苏云金芽孢杆菌CPB012菌株的杀虫功能基因鉴定及其-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2015,48(6):1112-1121 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.06.08 苏云金芽孢杆菌CPB012菌株的杀虫功能基因鉴定 及其对害虫的控制作用 陆慧慧，林志强，谭万忠，罗华东，鲜 菲，毕朝位，余 洋，杨宇衡 （西南大学植物保护学院外来入侵生物研究中心，重庆 400716 ） 摘要：【目的】分析并鉴定对马铃薯甲虫( Leptinotarsa decemlineata)具强致病性的苏云金芽孢杆菌 ( Bacillus thuringiensis)CPB012 菌株的杀虫基因型，为充分而有效地利用此生防菌奠定基础。【方法】CPB012 菌株在 LB 培养基上 30℃培养 2—3 d，用苯酚品红进行晶体染色，观察伴孢晶体形态。cry1—cry10 杀虫基因的 检测选用技术成熟的PCR-RFLP（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism）法， 即对某一类基因（如cry1、cry2…）保守区序列设计通用引物，并引入限制性内切酶识别序列，将扩增产物用相 应的限制性内切酶处理，得到的酶切图谱可以初步判断杀虫基因多态性。同时结合特异性 PCR 方法对二、三级分 类基因（如 cry1A、cry2Aa…）设计特异性引物进行扩增，将扩增产物测序比对。cry11—cry40 和 vip 基因通过 设计引物进行PCR检测。菌株在LB培养基上培养24、48、72 和96 h分别提取晶体蛋白，结合晶体蛋白的SDS 图谱分析其表达的杀虫蛋白。室内分别测定 CPB012 对鳞翅目家蚕(Bombyx mori)、鞘翅目马铃薯甲虫和双翅目橘 小实蝇(Bactrocera dorsalis)的杀虫效果；室内和田间测定 CPB012 与球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）MJ07 菌株对马铃薯甲虫的生物协同防治效果。【结果】通过菌株形态和晶体形态的连续观察，发现 CPB012 能够产生方 形和球形等晶体。基因型检测表明 CPB012 菌株含有 cry1Aa、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab 和 vip3A，结合蛋白电泳 图谱，其可能分别编码了约 135、80、70、85—90 kD 的大分子杀虫蛋白；同时可能还含有 30 和 50 kD 的两种新 蛋白。室内生测试验显示，除马铃薯甲虫外，CPB012对家蚕和橘小实蝇也具有很强的毒杀作用，处理7 d 后死亡 率分别为80.30%和76.72%。将CPB012与球孢白僵菌MJ07 菌株按0.5 ﹕0.5剂量混合后室内接种，处理14 d 后 2 龄马铃薯甲虫的累计死亡率达 96.5%，极显著地(P0.01)高于球孢白僵菌 MJ07 或苏云金芽孢杆菌 CPB012 单独处 理的累计死亡率90.1%(MJ07)或83.3%（CPB012）。多重线性回归方程计算得出单独接种CPB012的LC50 为1.88×107 7 7 cfu/mL,MJ07 的 LC 为 5.46×10 cfu/mL，而二者混用后 LC 为 1.10×10 cfu/mL，CTC（共毒系数）值为 254，增 50 50 效明显。在田间施用CPB012+MJ07混合剂(0.5 ﹕0.5)后对1龄和2龄马铃薯甲虫的防治效果分别为47.5%和43.8%, 显著高于MJ07、CPB012和Bt 药剂对照的防治效果。【结论】苏云金芽孢杆菌CPB012的杀虫功能由 cry1Aa、cry1Ia、 cry2Aa、cry2Ab和 vip3A等基因所决定，这些基因编码135、80、70、85-90 kD的杀