胃泌素及其受体拮抗剂作用下胃癌细胞DNMT1和MMP2ECadherin甲基化相关性研究.docVIP

胃泌素及其受体拮抗剂作用下胃癌细胞DNMT1和MMP2ECadherin甲基化相关性研究 　　【摘要】 目的：通过检测胃泌素及丙谷胺干预下胃癌MKN45细胞DNMT-1基因表达与E-Cadherin和MMP-2基因甲基化变化的相关性。方法：胃癌细胞株分别在胃泌素和丙谷胺干预下分为空白组、胃泌素组、丙谷胺组和混合组，应用SYBR Green I Q-PCR检测各组DNMT-1基因表达水平；运用RQ-MSP法检测用亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA为模板的各组基因甲基化状态。结果：胃泌素组与空白组相比，DNMT-1表达明显增高，而丙谷胺组则表达明显减低（P0.05）；DNMT-1表达量与E-Cadherin甲基化变化存在明显相关性，而与MMP-2甲基化并无明显相关性。结论：胃泌素可促进DNMT-1表达，DNMT-1可能直接影响E-Cadherin甲基化，而其可能间接影响MMP-2表达模式。 　　【关键词】 胃癌； 胃泌素； 丙谷胺； DNA甲基转移酶-1； 基质金属蛋白酶-2； E-钙粘蛋白； 甲基化 　　胃肠道是人体最大的内分泌器官，各种内分泌激素可通过细胞膜上相应受体结合而产生影响，激素分泌失调均可导致胃肠道疾病。胃泌素是一种多肽类激素，它的主要生物学作用是刺激壁细胞分泌胃酸。近年来研究证实，外源性胃泌素对胃癌、结肠癌等胃肠道肿瘤细胞生物学行为有影响作用，但胃泌素是否参与了胃癌细胞的侵袭、转移目前还不清楚。本研究旨在观察胃泌素影响DNMT-1基因表达，从而导致MMP-2和E-Cadherin甲基化改变，以此探讨胃泌素在改变胃癌细胞表达模式中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂与仪器 MKN45胃癌细胞系由南昌大学第一附属医院消化疾病研究所提供，5肽胃泌素购自上海丽珠东风生物技术公司，丙谷胺（分析纯）购自江苏金坛制药厂，各引物由上海天工生物合成，TIANGEN公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，荧光定量试剂盒（Takara Dalian）SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，DA7600自动实时荧光PCR仪。 　　1.2 细胞培养及实验分组 MKN45胃癌细胞系培养于DMEM培养液中，加10%小牛血清，置37 ℃、5%CO2恒温培养箱，隔天换液，3 d传代。用含10%小牛血清的DMEM液将胃泌素浓度配为25×2 ?g/mL，丙谷胺浓度为32×2 ?g/mL。实验共分四组：空白对照组、胃泌素组、丙谷胺组和胃泌素加丙谷胺组。取传代后72 h的细胞，用含10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为1×105接种于六孔培养皿，每孔1.2 mL，待细胞贴壁后弃去培养液，空白对照组加含10%小牛血清培养液10.0 mL，胃泌素组加胃泌素液5.0 mL，丙谷胺组加丙谷胺液5.0 mL，再各加含10%小牛血清培养液5.0 mL，胃泌素加丙谷胺组两者各加5.0 mL。培养48 h后，取出培养皿，从培养皿移去培养液，用胰蛋白酶消化方法收集细胞。 　　1.3 SYBR Green Ⅰ Q-PCR 　　1.3.1 总RNA提取及反转录 收集各组胃癌细胞，采用TIANGEN公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂盒操作步骤提取各组细胞总RNA，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总mRNA完整性及有无DNA污染，通过测A260值检测RNA浓度，测A260/A280值检测其纯度。用宝生物工程有限公司PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行反转录。 　　1.3.2 Q-PCR扩增 　　1.3.2.1 PCR 条件的摸索和优化：本研究采用PCR的序列如下（5 to 3）：DNMT-1上游CCAGGATTACAAGGAAAAGCAC下游TTCAGTTTCTGTTTGGGTGTTG，内参β-actin上游CCACGAAACTACGTTCAACTCC下游GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT。反应程序为95 ℃预变性30 s 1次，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s 40个循环。鉴定产物后，摸索PCR反应最适当的扩增条件，包括最适合的模板浓度、引物浓度0.2～1.0 μM及退火温度55～65 ℃，从而减少非特异性条带和引物二聚体的产生，减少测量误差。 　　1.3.2.2 SYBR Green Ⅰ法进行Q-PCR 荧光染料SYBR Green Ⅰ法进行PCR扩增，每份标本重复5次。反应体系20 μL： SYBR Green Ⅰ 10 μL，0.4 μM的引物上、下游各0.8 mL，模板2.0 μL，ddH2O补足体系。DNMT-1反应条件：95 ℃预变性30 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 30