LC―MSMS测定6种丹参主要有效成分及其脑靶向分布的研究.docVIP

LC―MSMS测定6种丹参主要有效成分及其脑靶向分布的研究 　　[摘要]建立测定大鼠血浆及脑匀浆中原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的LC-MS/MS分析方法。实验采用液液萃取的方法对血浆及脑匀浆样品进行处理，采用Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm， 3.5 μm），以0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱。质谱条件为电喷雾电离源（ESI），多反应监测（MRM）。正离子模式下检测的离子对（m/z）为297.4/254.3（隐丹参酮），295.5/249.3（丹参酮ⅡA），285.2/154.0（内标地西泮）；负离子模式下检测的离子对（m/z）为154.3/153.1（原儿茶酸），137.3/108（原儿茶醛），493.0/295.2（丹酚酸A），718.0/520.0（丹酚酸B），321.4/152.3（内标氯霉素）。血浆及脑匀浆中隐丹参酮、丹参酮ⅡA、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B的线性范围分别为：0.15～1 000，0.625～1 000，0.625～1 000， 0.625～1 000， 1.25～1 000，2.5～1 000 μg?L-1；定量下限分别为0.15，0.625，0.625，0.625，1.25，2.5 μg?L-1。建立的方法稳定、灵敏，可用于研究丹参6种成分的脑及血浆药物代谢动力学特性。通过动物实验比较了6种成分之间的血脑分配系数，初步评价其跨越血脑屏障的能力。 　　[关键词]LC-MS/MS；丹参主要有效成分；血脑分配系数；脑分布 　　丹参首载于《神农本草经》，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，具活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效，有“一味丹参，功同四物”之誉。丹参的重要活性成分是丹酚酸类，包括原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸A和B等近20种单体成分。此类成分药理活性广泛，有强抗氧化作用，对心肌缺血及脑缺血[1-3]有明显保护作用。其中丹酚酸B含量占总酚酸类比例较大，2010版药典以丹酚酸B作为丹参水溶性成分的评价指标。丹参脂溶性成分中具有代表性是丹参酮类，其中研究最多的是丹参酮ⅡA。它能显著降低脑缺血再灌注后血管内皮细胞表面ICAM-1的表达[4]，发挥重要脑保护作用。对丹参成分的体内药代动力学研究[5-6]，大都针对单一成分或几个化学性质类似的成分研究其代谢动力学，针对丹参主要有效成分之间缺乏系统的深入研究。本实验选取丹参中4种主要水溶性有效成分原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B及2种主要脂溶性有效成分隐丹参酮、丹参酮ⅡA，建立灵敏、稳定的6种药物血浆及脑匀浆中的LC-MS/MS检测方法。通过动物实验，比较6种成分的脑血分配系数（lgBB），初步评价其跨越血脑屏障的能力。 　　1材料 　　1.1药品与试剂 　　原儿茶酸（protocatechuic acid， PCA，纯度?98%）、原儿茶醛（protocatechuic aldehyde， PAL，纯度95%）、隐丹参酮（cryptotanshinone， CTS，纯度95%）、丹参酮ⅡA（tanshinone ⅡA， TSⅡA，纯度98%）对照品购于西安华萃生物技术有限公司。丹酚酸A（salvianolic acid A， SAA， 纯度?98%）、丹酚酸B（salvianolic acid B， SAB， 纯度?98%）对照品购于上海融禾医药科技有限公司，批号分别为130107， 091107。氯霉素（chloramphenicol， CAP，纯度?98%）对照品购于上海安普科学仪器有限公司，批号为C1112000。地西泮（diazepam， DZP，纯度?98%）对照品购于中国食品药品检定研究院，批号为1217-9201。乙腈（德国Merck）、乙酸乙酯（美国Honeywell）和甲酸均为色谱纯。 　　1.2动物 　　实验动物为SPF级雄性SD大鼠，体重250～280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012-0001。 　　1.3仪器 　　岛津LC-20A液相色谱仪（日本SHIMADZU）；5500QTrap串联四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB SCIEX），Analyst 1.6数据处理系统；真空冷凝旋转蒸发仪（美国Labconco）。 　　2方法 　　2.1动物实验 　　大鼠（n=5）股静脉分别注射PCA，PAL，SAA，SAB，CTS，TSⅡA，给药剂量依次为25，20，4，15，10，25 mg?kg-1。在40 min时静脉取血250 μL，离心取上清，同时断头取大脑皮层，样品均保存于-20 ℃冰箱。 　　2.2样