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cDNA 微阵列技术的研究进展 　　从1995年首次完成流感嗜血杆菌的全基因组测序到人类基因组计划接近尾声，全世界公共数据库和私人数据库中已积累了天文数字的多种生物的核酸和蛋白序列信息，且这个数字日益加速增大。现在生物学研究已进入功能基因组时代，研究重点是基因的功能、表达和调控，在这个时期充分利用公共数据库中丰富的序列信息资源具有举足轻重的意义。基因微阵列技术作为沟通基因序列信息与功能基因组间的桥梁，在后基因组时代将发挥日益重要的作用。 　　基因微阵列（microarray）又称基因芯片，是一类重要的生物芯片。它是把大量已知序列探针集成在一张基片上，然后把若干经过标记的靶基因序列与微阵列上的序列探针杂交。通过检测已杂交的探针，便可根据碱基互补配对的原理确定靶基因的序列，从而获得细胞或组织中大量的基因表达信息，实现对基因表达信息的同步大规模快速检测。基因微阵列可分为两种类型：寡聚核苷酸微阵列（oligonucleotide microarrays， genechips）和DNA片段微阵列（DNA fragment microararays），后者中的cDNA微阵列是将大量经过3’端或5’测序的cDNA经扩增后点在尼龙膜等聚合物基片上或玻璃片等刚性光学基片上而制成，在检测高等生物基因表达?V上具有其特有的优点。本文对cDNA微阵列技术的生物学基础、基本原理、制备方法、靶基因标记、杂交图像分析、杂交数据的提取和分析及应用进行综述。 　　1 cDNA微阵列技术的生物学基础 　　生物的生存和繁衍依赖于细胞对遗传指令的储存、阅读和翻译的能力。遗传信息通过细胞分裂由母细胞传给子细胞，通过生殖细胞由上一代传给下一代。遗传信息以基因的形式储存在每一个活细胞中，细胞依靠基因产物来进行产生能量、合成生物大分子、维持细胞结构和应答外界刺激等功能活动。蛋白质是细胞机器的工作组分，DNA中储存着蛋白合成的信息，而RNA携带着编码于DNA中的遗传指令，介导储存在DNA中信息的表达。mRNA是携带着蛋白质特异的氨基酸序列信息的转录本。 　　为了理解生物的发育、遗传疾病的发作、基因在调节细胞功能时的协同作用，最好的办法就是检测不同发育阶段、不同组织、及生病状态和健康状态下基因表达的波动变化。知道在各类组织、各个发育阶段、各种条件下的基因转录丰度有助于了解不同基因在其参与的细胞过程中所起的功能作用，也有助于理解其调控及基因之间和基因产物之间的相互作用。虽然mRNA并非基因的最终产物，但是基因调节的第一步就是转录，有关转录水平的信息对于了解基因调控网络是不可缺少的。mRNA的水平并不直接反映相应蛋白的丰度，但mRNA转录信息至少可以用于定量估计相应蛋白的水平。而且，目前测定mRNA的转录水平要比直接测定蛋白表达水平要经济的多，且可采用高通量的方法。 　　2 cDNA微阵列技术原理 　　核酸杂交是分子生物学的核心技术，也是基因微阵列技术的基本工作原理。应用已知序列的核酸探针对未知核酸序列进行杂交检测是分子生物学中常用的手段。由于核酸互补链相互之间的精确选择, 所以该方法具有高度灵敏性和特异性。传统上，核酸杂交是将待检测的多核苷酸复合物固定于固体支持物上，而在液相中使用一种高纯度的已标记过的寡核苷酸探针或多核苷酸探针。对于转录丰度的分析是将mRNA或总RNA固定在膜上,然后与以放射性元素标记的基因特异性探针共同温育。如果将多个RNA样品固定在同一张膜上，则可获得某基因在这多个样品中表达信息。 　　cDNA微阵列技术在多方面上改变了以上策略。各个基因的转录本mRNA 3′端序列可特异性地代表该基因。微阵列实验中,很多已 3′端测序的cDNA序列经扩增后被点逐个克隆的点在同一个矩阵上，其上每个点代表一个基因。以两种荧光染料（或同位素）分别标记试验细胞和对照细胞的总RNA，然后将已标记的靶基因同时与微阵列杂交, 即可根据产生的不同类型的荧光信号来确定样品中各基因转录本的相对数量。所得杂交结果可直接比较试验组与对照组中mRNA的相对丰度。这样，试验组与对照组有可互为参照。用同位素标记探针的试验方案与此类似,不过不能在一张芯片上同时将试验组样品和对照组样品进行杂交。这时由于需要进行平行杂交而导致可能在比较表达水平时产生较大误差。cDNA微阵列制作方法和杂交方法的灵活性使得该方法具有广阔的应用领域，唯一的限制因素是所拥有的已测序的cDNA克隆的数量和用于检测的样品RNA质量。 　　3 cDNA微阵列的制备 　　cDNA微阵列的制备时包括cDNA基因探针的制备，点样和基因探针在基片表面的固定三个步骤。首先按常规分子生物学方法制备cDNA探针库。可以用PCR扩增cDNA、EST文库等方法制备探针。基因探针常常直接从GenBank,dbEST及UniGene等数据