医学毕业论文大鼠传代培养肝细胞的形态学观察.docVIP

X X 大学 毕业论文 大鼠传代培养肝细胞的形态学观察 姓 名：__________ 2014年6月25日 大鼠传代培养肝细胞的形态学观察 【关键词】 肝/细胞学 关键词: 肝/细胞学;连续传代培养;显微镜检查，电子;大鼠 摘 要:目的 将大鼠肝细胞进行传代培养，并观察其形态学特点. 方法 采用胶原酶二步法灌注1mo龄SD雄性大鼠肝脏，制备肝细胞悬液并进行原代及传代培养，对其形态学进行了观察. 结果 肝细胞已传7代，每次传代培养6d左右，光镜下可见大量新生肝细胞生长，呈多边形，相嵌紧密排列.电镜下可见核变形，有的为双核细胞.此外，胞质内的糖原颗粒也逐渐减少. 结论 成功进行了肝细胞的传代培养，为肝细胞的研究提供了一种方便的研究方法. 　　Keyword:iiver/cytology;serial passage;microscopy，elec-tron;rats 　　Abstract:AIM To subculture rat hepatocytes and to ob-serve their morphological characteristics.METHODS Hepa-tocytes were isolated from1-month-old rats by two-step col-lagen perfusion.After cultured for20d，the primary culture-sof hepatocytes were separated with trypsin and then subcul-tured for7generations whose morphological characteristics were studied.RESULTS Six days after the subculture，hep-atocytes were observed under light microscope，and a great number of neoformative polygon hepatocytes were found.They were closely arranged.The nucleus of subcultured hep-atocytes became deformed under TEM.Some of them were binuclear.Besides，glycogen in the cytoplasm decreased.CONCLUSION Subculture rat hepatocytes provide a conve-nient method for the study of hepatocytes. 　　0 引言 　　在研究体外肝脏多种多样的功能中，需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.1969年Berry和Friend用胶原酶灌注分离细胞，使细胞产量大幅度提高，这些细胞具有许多肝脏功能.我们在肝细胞原代培养的基础上，又成功地进行了肝细胞的传代培养，以利于肝细胞的研究. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 上海产1mo龄SD雄性大鼠，体质量90～100g.DMEM培养基（Gibco公司），0.3gL-1 Ⅰ型胶原酶溶液5.0mL（Sigma公司，DMEM为溶剂），磷酸缓冲液（PBS）250mL，RDB-TB蠕动泵（江苏省张家港市仪表仪器总厂），离心机，型号为Biofuge15R（德国Heraeus公司）. 　　1.2 方法 SD雄性大鼠腹部消毒后按2mLkg-1 ，ip，10gL-1 戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定.脱去胸腹部毛，消毒，无菌操作下，开胸将导管插入下腔静脉胸段，丝线固定.开腹显露门静脉，远离肝脏处结扎肝动脉、脾静脉、下腔静脉与肾静脉汇合处，剪破门静脉近肝脏处，以9mLmin-1 速度灌注PBS15min，以8mLmin-1 速度灌注Ⅰ型胶原酶溶液10min，收集细胞于DMEM中，依次经100，150，180，280，400目不锈钢滤网过滤后的细胞悬液于4℃，50g离心2min，弃上清，反复离心3次，沉积的细胞用含100mLL-1 小牛血清DMEM调整细胞密度为2×108 L -1 ，台盼蓝拒染法测细胞活力0.90，以此细胞密度在6孔培养板中加入细胞4×105 /孔.36h后首次换液，以后每48h换液1次.肝细胞培养20d时，于位相差倒置显微镜下可见细胞融合成片.传代前用无血清培养基培养1d，弃去培养液，加入1.25mLL-1 胰蛋白酶（1mL/孔）于