咽炎方含片高效液相色谱指纹图谱的研究.docVIP

咽炎方含片高效液相色谱指纹图谱的研究 　　摘要：目的 建立咽炎方含片高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法 采用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，检测波长203 nm，柱温为室温，流速1.0 mL/min。结果 该色谱条件下咽炎方含片各成分得到了较好的分离，标准指纹图谱由9个特征峰组成。10个批次的样品指纹图谱相似度为0.8586～0.9902。结论 HPLC 指纹图谱具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，可用于咽炎方含片的质量控制。 　　关键词：咽炎方含片；指纹图谱；高效液相色谱法 　　咽炎方含片由广东土牛膝、岗梅根和甘草组成，用于治疗急慢性咽炎、咽喉肿痛、扁桃体炎，是中山大学附属第一医院临床应用多年的经验方。方中广东土牛膝、岗梅根均为广东地产药材，其化学成分、尤其是有效成分或标志性化合物尚未明确，给有效控制及评价该制剂的质量带来了一定的困难。鉴于指纹图谱技术是一种多组分复杂样品质量评价的有效方法，本试验拟建立该制剂的中药高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，以便更全面地控制该制剂的质量。 　　1 仪器与试药 　　Waters 515液相色谱仪，AL204型电子天平（瑞士METTLER- TOLEDO公司）。 　　甘草苷对照品（批号111610-200604）购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。咽炎方含片样品为中山大学附属第一医院药学部自制。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件 　　采用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序为：0～30 min， 85%～75%A；30～40 min，75%～65%A；40～50 min，65%～85%A；50～60 min，85%A。检测波长为203 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min。 　　基金项目：广东省重大科技专项（2011A080300004） 　　通讯作者：任斌，E-mail：renbinsys@ 　　2.2 供试品溶液的制备 　　取20 片咽炎方含片，研细，取约6.0 g 片粉，精密称定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇至90 mL，超声（1 200 W，20 kHz）处理15 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[1]。 　　2.3 方法学验证 　　2.3.1 精密度试验 取同一批号样品，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下，重复进样5次，记录指纹图谱。结果各色谱峰对参照峰（7号峰，甘草苷）相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于4.0%，符合指纹图谱要求。 　　2.3.2 重复性试验 取同一批号样品5份，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于3.6%，符合指纹图谱要求。 　　2.3.3 稳定性试验 取同一批号样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于2.7%。结果表明，咽炎方含片样品溶液在24 h内稳定。 　　2.4 指纹图谱的建立 　　2.4.1 特征峰的确定 在上述色谱条件下，测定10批咽炎方含片，记录图谱。对10批供试品结果进行分析比较，标定了9个共有指纹峰，典型色谱图见图1。2、4、6号峰来源于广东土牛膝，1、5、9号峰来源于岗梅根，3、7、8号峰来源于甘草。 　　2.4.2 参照峰的选择 保留时间为25.1 min的7号色谱峰峰面积较大，出峰时间适中且稳定，经标准品对照认定为甘草苷的吸收峰，因此选择甘草苷作为HPLC指纹图谱的参照峰，以其保留时间和峰面积为1.0，计算各批指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。 　　2.4.3 相似度分析 采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（版本2004 A），对10批咽炎方含片的指纹图谱进行分析，以色谱峰的平均值建立对照指纹图谱，利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，结果见表3。 　　3 讨论 　　本研究考察了3种不同型号色谱柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamond C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果表明， Phenomenex Luna C18柱分离出的色谱峰分离度好、