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外周血造血干细胞低温冻存的研究 　　【中图分类号】R733.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2011）02-0229-02 　　作者简介：王志国(1973-),男，副主任医师，硕士，主要从事造血干细胞移植工作。 　　【摘要】外周血干细胞冻存是外周血干细胞移植成功的关键技术之一，探索一种安全简便的外周血干细胞冻存方法可以更加方便临床应用。应用终浓度为5 %二甲基亚砜(DMSO),3 %羟乙基淀粉(HES)和2%人血白蛋白(ALB)作为干细胞保护剂-80℃低温冰箱储存外周血干细胞，分析169份造血干细胞回输前后资料; 台盼兰检测细胞成活率，Mouse anti-Human CD34检测干祖细胞比例变化, 人造血干细胞甲基纤维素培养基MethoCult ○R GFH4534检测细胞活性。结果表明:根据复苏细胞时间的不同，不同冻存时间的造血干细胞在半年内复苏的活性变化差异不大，6个月时,冻存干细胞的细胞活性、MNC 回收率、GM-CFU和CD34 + 细胞回收率以分别为84. 62%、87. 87%、92. 92%、93.28%与冻存1个月相比无统计学差异(P0.05) ,但在冻存1年时，造血干细胞的细胞活性及GM-CFU与冻存1个月相比有统计学差异( P0.05)，在造血干细胞冻存后三个月内复苏回输干细胞的移植患者，造血干细胞在患者体内增殖效果没有显著差异。结论：采用终浓度为5% ?DMSO,?3% HES 和2%人血白蛋白作为干细胞冷冻保护剂，在- 80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种比较好的外周血干细胞冻存方法,临床应用此方法短期冻存造血干细胞安全可靠。 　　【关键词】外周血干细胞；冷冻保存；移植 　　 　　外周血造血干细胞移植已经广泛应用于很多医学领域，在恶性血液病中的应用尤为广泛，其中造血干细胞的冷冻保存对于外周血干细胞移植中能否成功已经成为关键技术，并且探讨和证实这些方法的安全性和有效性可以为循证医学提供更有力的证据。我们应用终浓度为5 %二甲基亚砜(DMSO) 、3 %羟乙基淀粉(HES) 、2 %人体白蛋白(HSA)的外周血干细胞冻存剂冻存外周血干细胞，对169份标本进行分析，证实该方法在临床上的有效性。? 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂:DMSO(100% ,Amresco)，羟乙基淀粉(6% ,德国费森尤斯卡比有限公司)，人血白蛋白(20% ,哈尔滨世享生物工程药业股份有限公司)，Mouse anti-Human CD34（BD公司，cat:550761）。 　　1.2 病例与外周血干细胞动员采集:169份外周血干细胞冻存标本，患者年龄7～63 岁,中位年龄25 岁。所有样本均为自体外周血干细胞。采用的化疗方案为CY+TBI,在白细胞降至低谷并开始回升时给予G-CSF动员 ,当WBC10.0×10?9/L时开始采集。经采集后,获得外周血干细胞达到MNC4.5×10?8/kg ,CD34+细胞4×10?6/kg的标准再进行移植回输。 　　1.3 外周血造血干细胞的冻存:DMSO，羟乙基淀粉，人血白蛋白按比例与采集的干细胞液混合,使DMSO、羟乙基淀粉及人血白蛋白的终浓度分别为5%、3%和2% ,然后分装于冻存袋(50ml,美国百特公司) 中, 平放以便降温均匀,直接置于-80℃冰箱(中国海尔公司) 中保存。留少许样品送检:台盼蓝染色、MNC计数、CFU2-GM检测（人造血干细胞甲基纤维素培养基MethoCult ○R GF H4534）、CD34+ 细胞检测(BD公司FACSCantoTMII) 。 　　1.4 外周血造血干细胞的复苏:回输时将冻存袋从- 80 ℃冰箱中取出,尽快放置于39 ℃水浴箱中快速解冻,以防止冰晶的形成,解冻后的干细胞在短时间内回输到患者体内,同时留少许样品进行检测。 　　1.5 外周血造血干细胞检测:对采集的外周血干细胞和复苏后的外周血干细胞分别取样进行台盼蓝拒染率、MNC 计数、CFU-GM、CD34 + 细胞指标检测,计算回收率。 　　1.6 外周血干细胞在患者体内的重建:患者在回输外周血造血干细胞后恢复造血的指标为：外周血中白细胞1000/ml; 血小板20000/ml。患者细胞回输当天为零天，以此计算造血恢复时间。 　　1.7 统计学处理:检测结果以均数±标准差(x±s)表示, t 检验求出P 值进行分析。? 　　2 结果 　　2.1 外周血造血干细胞台盼蓝拒染率检测:台盼蓝拒染率结果显示, 随着外周血造血干细胞冻存时间的延长, 细胞在复苏后的台盼蓝拒染率逐渐降低，30天复苏细胞的台盼蓝拒染率是93.24%，与冻存后360天及400天相比较有统计学差异（P 0. 05） (图1)。 　　Figure 1 Rates o