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头孢菌素合成酶无载体固定化工艺的研究 　　【摘 要】本实验对头孢菌素合成酶无载体固定化工艺进行研究。本实验对头孢菌素合成酶交联聚集体制备的固定化温度、固定化时间、固定化PH进行考察。最佳制备条件为固定化温度为5摄氏度、固定化时间90分钟、固定化PH为7.头孢菌素合成酶转化试验转化收率为73.2%。 　　【关键词】头孢菌素；合成；研究 　　头孢菌素类是由冠头孢菌培养液中分离的头孢菌素C，经改造侧链而得到的一系列半合成抗生素。头孢菌素具有抗菌谱广、引起的过敏反应较青霉素类低、对厌氧菌有高效、对酸及对各种细菌产生的β-内酰胺酶较稳定等优点。头孢菌素类由于其不良反应和毒副作用较低，是当前开发较快的一类抗生素。本实验对头孢菌素合成酶无载体固定化工艺进行研究。 　　1.仪器与试剂 　　PHscan30型酸度计（苏州江东精密仪器有限公司）；PILOT VAP 10-50大型旋转蒸发仪（北京赛美思仪器设备有限公司）；KHW-D-1LC精密拉伸水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）；scientz98-III杯式超声波粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LC-15C高效液相色谱仪（成都安恒达科技有限公司）；YOKO-2005双波长薄层色谱扫仪（武汉药科新技术开发有限公司）；TGL20MW台式大容量高速冷冻离心机（湖南赫西离心机仪器有限公司）；QT3120K脱气可调型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）；奥豪斯Explorer专业型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；XYG-H帕恩特痕量分析级超纯水机（北京湘顺源科技有限公司）。聚乙二醇（贵州陇盛达生物科技有限公司）、戊二醛（湖北巨胜科技有限公司）、苯甘氨酸甲酯（上海瀚鸿化工科技有限公司）。 　　2.实验 　　2.1头孢菌素合成酶交联聚集体制备条件比较试验 　　2.1.1固定化温度的影响 　　分别取酶上清液200毫升，加入30克聚乙二醇溶解，再加入3克戊二醛，分别在5摄氏度、10摄氏度、15摄氏度、20摄氏度、25摄氏度、30摄氏度下反应120分钟，过滤，洗涤，检测交联酶聚集体活性。当反应温度为5摄氏度时固定化收率为百分之七十九点三；当反应温度为10摄氏度时固定化收率为百分之七十六点三；当反应温度为15摄氏度时固定化收率为百分之七十一点二；当反应温度为20摄氏度时固定化收率为百分之六十八点三；当反应温度为25摄氏度时固定化收率为百分之六十六点五；当反应温度为30摄氏度时固定化收率为百分之六十二点一。实验结果表明随着温度的升高，固定化收率降低，所以采用5摄氏度为反应温度。 　　2.1.2固定化时间的影响 　　分别取酶上清液200毫升， 加入30克聚乙二醇溶解，再加入3克戊二醛，在5摄氏度分别采用30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分为反应时间进行实验，过滤，洗涤，检测交联酶聚集体活性。采用30分钟反应时间时固定化收率为百分之八十三点五，聚集体颗粒大小不合格；采用60分钟反应时间时固定化收率为百分之七十九点一，聚集体颗粒大小部分合格；采用90分钟反应时间时固定化收率为百分之七十二点一，聚集体颗粒大小合格；采用120分钟反应时间时固定化收率为百分之六十一点六，聚集体颗粒大小合格；采用150分钟反应时间时固定化收率为百分之四十二点三，聚集体颗粒大小合格。实验结果表明反应时间为90分钟实验效果最好，所以选择90分钟为反应时间。 　　2.1.3固定化PH的影响 　　分别取酶上清液200毫升，分别调PH值为4、5、6、7、8、9、10， 加入30克聚乙二醇溶解，再加入3克戊二醛，在5摄氏度反应90分钟，过滤，洗涤，检测交联酶聚集体活性。当反应PH值为4时固定化收率为百分之三十三点五；当反应PH值为5时固定化收率为百分之五十点二；当反应PH值为6时固定化收率为百分之六十三点三；当反应PH值为7时固定化收率为百分之七十九点五；当反应PH值为8时固定化收率为百分之六十三点二；当反应PH值为9时固定化收率为百分之四十二点六；当反应PH值为10时固定化收率为百分之二十九点五。实验结果表明反应PH值为7实验效果最好，所以7为反应PH值。 　　2.2头孢克洛酶转化试验 　　采用苯甘氨酸甲酯与7-氨基-3氯代头孢烷酸比例为2.5：1，PH值为6，反应温度为三十摄氏度，无载体固定化酶使用量为5U/ml进行头孢菌素合成酶转化试验。固定化酶成功的得到了头孢克洛产品，转化收率为73.2%。 　　3.讨论 　　头孢克洛属第二代口服头孢菌素，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很强的杀灭作用[1-5]。头孢克洛为广谱半合成头孢菌素类抗生素。头孢克洛对产青霉素酶金黄色葡萄球菌、A组溶血性链球菌、草绿色链球菌、对不产酶金黄色葡萄球菌和肺炎球菌具有抗菌作用[6-9]。头孢克洛常用于咽喉炎、扁桃