彗星试验检测哺乳动物细胞DNA损伤样品制备的方法.docVIP

彗星试验检测哺乳动物细胞DNA损伤样品制备的方法 　　摘要：彗星试验（comet assay）是近年来逐步发展起来的1种检测单细胞水平DNA损伤的新技术，该技术已被广泛应用于遗传毒理学、，辐射生物学、环境生态学等领域。在碱性SCGE基础上，对哺乳动物细胞SCGE检测样品制备的方法进行了改进与优化，使改进后的方法更加快速简便、易于推广。 　　关键词：彗星实验（单细胞凝胶电泳）；DNA损伤；HepG2细胞；电泳图像质量 　　中图分类号： Q291；X503.22文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0041-02 　　收稿日期：2013-10-04 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；江苏省高校自然科学基金（编号：11KJB610001）；中国博士后科学基金（编号：20100470062）；江苏省博士后基金（编号：1001024C）。 　　作者简介：王楠（1984―），男，山西大同人，硕士，从事环境毒理学研究。E-mail：nan.wuhan.2006@163.com 　　通信作者：杜道林，博士，教授，从事生态学研究。E-mail：ddl@。DNA存储着生物体赖以生存繁衍的遗传信息，细胞DNA损伤是细胞生物学领域的研究热点之一。当细胞受到损伤时，其DNA双链会发生断裂，断裂过程中会发生特异性级联生化反应，依赖Ca2+、Mg2+的核酸内切酶被激活，优先作用于连接DNA的核小体间区域，将DNA链切割成180～200 bp或其倍数的片段，在彗星电泳中发生断裂的DNA迁移速度与迁移距离均数倍于正常细胞的核DNA，呈现脱离细胞核的“彗星”状，据此可将DNA受损细胞与正常细胞区分开[1]。彗星试验（comet assay）也被称作单细胞凝胶电泳（SCGE），是1种在单细胞水平上检测真核细胞DNA损伤的方法。通过测定细胞电泳时彗星出现率、彗尾DNA含量百分比、彗尾长度等指标，即可对细胞药物引起细胞DNA损伤进行全面评价[2]。1993年，Olive等首次将彗星试验应用于细胞凋亡检测[3]。真核细胞的DNA分子量较大，DNA呈负超螺旋结构附着在核基质中，采用琼脂糖凝胶将细胞包埋在细胞裂解液下，细胞膜、核膜等被破坏，细胞内的RNA、蛋白质等其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，核DNA仍然保持缠绕状，附着在剩余的核骨架上，并留在原位。在强碱（pH值为13）电泳液中电泳时，若细胞未受到损伤，核DNA分子量大且未发生断裂，仍停留在核基质中，经荧光染料染色后，核在原位形成1个明亮的头部，无拖尾现象；若细胞受损，会出现DNA单链或双链断裂，强碱环境下DNA解旋为单链，DNA断裂片段进入凝胶中，在电场力作用下，断裂的DNA片段因携带负电荷脱离核DNA向阳极移动，DNA碎片形成彗星状尾部，即可形成彗星图像。彗星电泳检测技术具有所需样品量少、适用于任何真核细胞、灵敏度高、细胞不需处于有丝分裂期、无需放射性标记等优点，已被广泛应用于真核细胞DNA损伤及修复、药物筛选、肿瘤发病机制与治疗等研究。目前，用于彗星电泳检测分析的样品制备过程主要包括样品凝胶制备、细胞裂解、解旋与电泳、中和洗涤、荧光染色、采用彗星凝胶电泳摄像系统拍摄荧光照片等步骤。通常，荧光染色步骤中所使用的荧光染料为溴化乙锭（ethidium bromide，EB），EB是1种强诱变剂，容易挥发，对操作人员的健康造成威胁。使用后的染色玻片直接扔进垃圾箱可能会对周围环境造成潜在危害。此外，目前用于彗星电泳分析所制备的凝胶玻片通常要铺3层凝胶，且在后续裂解、电泳及漂洗过程中，凝胶极易脱离载玻片，造成制胶失败，影响彗星电泳技术的推广与应用。咪唑类离子液体因具有不挥发、不易燃、导电性强、性质稳定、对许多无机盐及有机物有良好的溶解性等物化性质，使得其在化学合成、催化、电化学、分析化学等领域得到了广泛应用[4]。然而，研究表明，咪唑类离子液体不仅对细菌及真菌的生长具有很强的抑制作用，对人类上皮细胞也具有较强的细胞毒性，且细胞毒性随着离子液体烷基侧链长度的增加而增加[5-8]。本研究采用基于人肝脏肿瘤细胞系HepG2的彗星试验检测了离子液体1-丁基-3-甲基溴代盐（[C8mim]Br）的DNA损伤作用，旨在为评价咪唑类离子液体的遗传毒性提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　[C8mim]Br（上海成捷化学有限公司），纯度99%，[C8mim]Br用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（PBS）溶解，贮存液浓度为10 mol/L，4 ℃保存，临用时用10%胎牛血清培养液稀释至所需浓度；DMEM培养基、正常熔点琼脂糖（NMA）、低熔点琼脂糖（LMA）、Gel Red核酸凝胶染料均为美国Gibco公司产品；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），