超声联合SonoVue辐照介导FD500转入人前列腺癌两种细胞株的辐照方法和条件的实验分析-影像医学与核医学专业论文.docxVIP

上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 PAGE PAGE 10 第Ⅰ部分 超声辐照方法以及辐照参数对人前 列腺癌两种细胞的通透性和存活率的影响 第一章 二次超声辐照和一次超声辐照对人前列腺癌 两种细胞的通透性和存活率的影响 引言 超声辐照引起的空化效应能够增加细胞膜的通透性，是基因转染的重要方法 之一[1]。近年来有关如何提高超声辐照法介导基因转染率方面的研究已有不少报 道，通过调整辐照参数获得基因转染率的提高是这些研究的主要主题和内容[2]。 然而，就目前的研究结果显示大部分实验细胞在经过一次超声辐照后有基因物质 转入的仅为少部分细胞，大部分细胞的胞浆内仍无基因物质[3]，因而该法的基因 转染率仍偏低。除超声辐照参数外，辐照方法如直接法和水浴法、单次照射和多 次照射等是否也是影响胞膜通透性改变的因素，使之提高还是降低？对于这方面 的研究目前尚未见报道。本实验采用单次超声及二次超声辐照方法分别对人 PC3 和 LNcap 细胞进行辐照，通过比较两种辐照方法对细胞通透性和存活率的影响来 讨论这二种超声辐照方法对基因转染效率的影响。 材料与方法 1 材料： 人前列腺癌 PC3 细胞和 LNcap 细胞（上海中科院细胞库） F12 培养基、胎牛血清以及胰酶：美国 Gibco 公司 大分子荧光物质 FD500：美国 Sigma 公司 微泡造影剂 SonoVue：意大利 Bracoo 公司 2 仪器： 超声治疗仪：US700，日本 ITO Co.,LTD 公司（图 1-1） 恒温水浴箱：KS-22,美国 BD 公司 流式细胞仪：FC500,美国 Beckman 公司 荧光显微：CX51，日本 Olympus 公司 EP 管：美国 Axygen 公司 图 1-1 超声治疗仪及其探头 Fig 1-1 Therapic Ultrasound instrusment and the two transducers 3 细胞培养： 两种细胞都以含 10%胎牛血清的 F12 培养基培养。实验前一天给细胞更换培 养液，实验当天选对数生长期细胞进行实验。 4 实验分组： 实验分为二次辐照组和单次辐照组。 ① 二次超声辐照组：在 SonoVue 浓度为 20%的条件下，细胞分别以声强 0.6w ∕cm2 和 0.9w∕cm2 辐照 20s。辐照完毕，将细胞悬液常温静置 5min 后再以同样 的声强辐照 20s。 ② 单次超声辐照组：在 SonoVue 浓度为 20%的条件下，细胞分别以声强 0.6w ∕cm2 和 0.9w∕cm2 辐照 20s。 5 辐照前的准备工作 ① 水浴箱内倒入新制备的去离子水，调温至 37 度。 ② 用注射器将 5ml PBS 注入 SonoVue 冻干粉瓶内，摇匀至粉末完全溶解。 ③ FD500 以 PBS 溶解，FD500 溶液浓度为 12mg/ml。 ④ 细胞以胰酶消化后用 PBS 制成细胞悬液。以细胞计数器和细胞密度板检 测细胞悬液的细胞密度，并将细胞密度调整为 4×106/ml。 ⑤用移液枪向 1.5mlEP 管内依次加入 SonoVue 混悬液、FD500 溶液和细悬液， 然后用 PBS 将 EP 管内液体总量补至 600ul，使 EP 管内细胞密度为 1×106∕ml， FD500 溶液浓度为 1.0mg/ ml。 6 超声辐照方法 ① 混匀 EP 管内液体，然后将 EP 管直立于水浴箱底部。 ② EP 管的一侧放置超声探头，探头紧贴 EP 管并覆盖其长轴，另一侧放置 吸音海绵以吸收声波减少回波干扰。 ③ 超声治疗仪的探头频率设置为 1MHz，采用 CW 模式。 ④ PC3 和 LNcap 细胞分别按二次超声辐照组和单次超声辐照组的辐照条件 进行辐照，每种辐照条件进行 5 次重复实验。 7 细胞发光率和存活率检测 辐照完毕后混匀细胞悬液，取 580ul 细胞悬液移到离心管，以 PBS 洗涤后 离心，重复三次后以荧光显微镜观察细胞的发光情况，并以流式细胞仪检测细胞 的发光率。 将剩余的 20ul 细胞悬液和等体积的台盼蓝染液混匀，染色 3min 后，用高倍 显微镜观察细胞涂片，随机选五个视野计数后取平均值。 8 统计分析 采用 SPSS13.0 统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示， 两组均数间的比较采用 t 检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。 结果 1 以二次超声辐照和单次超声辐照时细胞发光率的比较 二次超声辐照和单次超声辐照时细胞发光率的比较见表 1-1。 ① PC3 细胞以声强 0.6w∕cm2、时间 20s 辐照后，流式细胞仪测得二次辐照 组的细胞发光率为 6.16±1.11%，单次辐照组的细胞发光率为 10.20±0.74%，两 组的差异