多肽ELISA方法建立及其在肝癌早期诊断相关研究中的初步应用-药物分析学专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 10 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 AFP Alpha Fetoprotein 甲胎蛋白 BSA Bovine Serum Albumin 牛血清白蛋白 DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium 培养液 DMSO Dimethylsulfoxide 二甲基亚砜 ELISA Enzyme－Linked Immunosorbent Assay 酶联免疫吸附分析法 HCC Hepatocellular carcinoma 原发性肝细胞癌 HRP Horseradish Peroxidase 辣根过氧化物酶 HAT Hypoxanthine Aminoopterin Thymidine  次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧 啶核苷 KLH Keyhole Limpet Hemocyanin 钥孔戚血蓝 mAb Monoclonal antibody 单克隆抗体 PEG Polyethylene Glycol 聚乙二醇 ROC Curve Receiver Operating Characteristic Curve  特征工作曲线 TMB 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 多肽 ELISA 方法建立及其在肝癌早期 诊断相关研究中的初步应用 摘 要 肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是世界上各种实体肿瘤中预后效果 较差的恶性肿瘤之一，并具有与乙肝、肝硬化等密切联系的疾病特点。因此，癌 症的早期预警技术研究对于预防肝癌、预测肝癌的发病趋势具有非常重要的研究 价值和社会意义。目前临床上广泛应用的肝癌诊断标志物 AFP，对于肿瘤直径 小于 3cm 的肝癌患者其敏感性、特异性均不理想。近几年，国际上许多研究人 员发现血清中丰富的多肽资源可以扮演肿瘤标志物这个重要角色，对于肿瘤的早 期预警、早期诊断具有重要的研究意义。其中，有报道称多肽 Pep5 是潜在的肿 瘤诊断标志物之一。本论文建立了检测多肽标志物 Pep5 的 ELISA 方法，同时应 用于肝癌患者的检测分析，评价其诊断肝癌的价值与临床意义。 首先我们采用传统的单克隆抗体制备方法成功建立针对 Pep5 的 3 株杂交瘤 细胞株，即 2F6、4F6 及 7G7，上清抗体的灵敏度均达到 10ng/ml。同时制备 3 种细胞株的腹水抗体，总计 41ml，效价均在 1:2000000 以上。并进行纯化与酶 标，共得到纯化抗体 28ml，2F6 及 7F7 滴度达 0.5ng/ml，4F6 为 5ng/ml。3 种高 灵敏度、高特异性的抗体为后续方法建立奠定了基础。 应用所制备的抗体，本文分别建立三种检测 Pep5 的 ELISA 方法，即直接法、 夹心法与竞争法，并分别进行关键条件的优化。直接法优化结果为 HRP-2F6 浓 度 1.25ug/ml，血清 1:20 稀释；夹心法为 7G7 单抗 1:2000 包被，HRP-2F6 浓度 为 5μg/ml，血清 1:10 稀释；竞争法 Pep 抗原 0.5ng 包被，HRP-2F6 为 1:20000 稀释，血清 1:5 稀释。我们使用三种方法分别验证小量样本，其中直接法区分肝 癌与正常组效果最好（P10-6），敏感性 93.3%，特异性 83.3%。 本文分别对优化后的直接 ELISA 方法的线性范围、检测限、精密性、回收 率进行评价。其中在 1.5-20ng/ml 范围内线性关系良好，检测限为 1.24ng/ml，相 关系数为 0.9959。我们分别取 9、12、15ng/ml 合成多肽进行检测，得到批内与 批间 CV 为 1.44%-6.17%，日内与日间 CV 为 2.89%-4.89%，回收率分别为 98.98%， 99.61%，101.58%。评价结果表明，优化后的直接 ELISA 法适用于血清中多肽的 检测。 最后采用直接 ELISA 法检测 420 例临床血清，正常组与肝癌组差异显著 （P0.001）。当 Pep5 的诊断阈值为 7.48ng/ml 时，诊断肝癌的敏感性为 80.8％， 特异性为 96.2%。经检测 94 例肝癌血清时，Pep5 的检出率（90.4%）高于 AFP （63.8%），两者联合检测检出率可达到 94.7%。终上所述，采用直接 ELSIA 方 法检测临床血清中的多肽标志物 Pep5，可以明显提高肝癌的检测敏感性，对于 肝癌血清学诊断具有重要的研究意义。 关键词：单克隆抗体 ELISA 多肽标志物 肝癌 Detection of polypeptide ELISA and its application of relative research