产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶解产物分析生物工程专业论文.docx

I I 产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵条件 优化及酶解产物分析 摘要 硫酸软骨素酶（chondroitinase,ChSase),是一类主要存在于微生物体内， 能将多种酸性粘多糖如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、透明质酸等降解为寡糖及不饱 和二糖的裂解酶。该酶在研究机体内硫酸软骨素糖胺多糖的功能、结构与分布方 面、在治疗动脉粥样硬化、关节炎等方面有着广泛的应用前景，同时，也用于制 备低分子量硫酸软骨素。低分子量硫酸软骨素对防治风湿性炎症和动脉粥样硬化 方面相对于大分子量硫酸软骨素有更好的疗效。利用酶解法制备低分子量硫酸软 骨素相对于目前广泛采用的物理降解法、化学降解法不需要较高的实验设备，也 不会污染环境。因此，获得大量的酶活力高的 ChSase 具有重要的理论和现实意 义,也是本实验的目的。因而本论文对产 ChSase 菌株的筛选、菌株产酶条件、菌 株的鉴定、酶解产物等做了系统的研究。 在本实验中，利用平板快速筛选和复筛从土壤中筛选出一株高产 ChSase 菌 株，编号为 12，通过对其形态和 16SrRNA 基因序列的比对，将该菌株鉴定为节 杆菌属菌株（Arthrobacter sp.），产酶方式为分泌型表达。 为了提高 12 号菌株的产酶水平，采用单次单因素实验方法对其碳源、氮源、 无机盐及各发酵条件进行了研究，采用正交实验方法对碳源浓度、氮源浓度、无 机盐浓度及 pH 进行了研究。得到的最佳培养基组分为（w/v）：硫酸软骨素 0.8%、 KH2PO4 0.02%、酵母浸粉 0.6%、MgSO4·7H20 0.8%、初始 pH6；最适发酵条件为： 按 1.5%（v/v）接种量将种子菌液接入 50ml/250ml 的三角瓶中于 25℃，150r/min 振荡通气培养 72h。以上述条件发酵培养食砜节杆菌时，酶活力可达 3.981U/mL, 为目前已报道的产酶活力较高的菌株。 最后，本文初步分析了 12 号菌株产生的硫酸软骨素酶的酶解产物。质谱分 析的结果显示，该酶降解硫酸软骨素的产物几乎全为单糖和二糖，有较高的纯度， 测得的降解产物中二糖的相对分子质量约为 458Da，单糖的相对分子质量为 228Da。 关键词：硫酸软骨素酶，食砜节杆菌，发酵条件优化，酶解产物 II II The screening of chondroitinase producing strain, optimization of fermentation conditions and analysis of hydrolysatese Abstract Chondroitinase (ChSase)is a lyase,which exists in microorganisms, and degrades a variety of acidic mucopolysaccharides such as sulfuric acid,dermatan sulfate,chondroitin sulfate and hyaluronic acid to oligosaccharide and unsaturated disaccharides. The enzyme has a broad application prospects in many aspects such as researching the function, structure and distribution of the vivo chondroitin sulfate glycosaminoglycan and the treatment of atherosclerosis, arthritis, etc. Meanwhile, the enzyme is also used for the preparation of low-molecular-weight chondroitin sulfate. Low-molecular-weight chondroitin sulfate whose molecular is 2-10kDa has a better efficiency than large molecular weight chondroitin sulfate in prevention and treatment of rheumatic inflammation and atherosclerosis.Relative to the currently widely used methords such as acid hydrolysis and ion exchange ,the enzymatic production of low molecular