茶树花青素还原酶的酶学特性研究-植物学专业论文.docxVIP

I I 摘要 儿茶素是茶树的主要次生代谢产物，也是决定茶叶品质及其健康功效的重要组 分。茶树花青素还原酶(CsANR)可以催化花青素转变为相应的 2,3-顺式-黄烷-3-醇， 它是决定茶树儿茶素合成的直接酶类。作为原花青素生物合成途径中的关键酶，国内 外研究者及本课题组前期工作已经对花青素还原酶基因及其酶学性质有了初步研究， 但是也发现了很多疑问。 本文首先初步纯化了茶树鲜叶中和通过原核表达的 CsANR 蛋白，并采用 C18 柱 和旋光异构柱分离，结合 HPLC 技术，鉴定了两种来源的 ANR 蛋白酶反应产物的差 异。其次，利用原核表达的重组 ANR 蛋白，比较了两种重组 ANR 酶的酶学特性差 异。 主要研究结果如下： 1.为排除茶树鲜叶中的氧化酶干扰，本文采取硫酸铵沉淀法，对 CsANR 酶进 行了初步纯化。结果发现，CsANR 酶反应产物更易于检测。利用 C18 柱和旋光异构 柱分离，结合 HPLC 检测技术，对来自茶鲜叶的 CsANR 酶反应产物进行分析，结果 表明，以矢车菊色素（CYA）和飞燕草色素（DEL）为底物时，CsANR 酶生成的 主要产物分别是 2,3-顺式-黄烷-3-醇（-）EC 和（-）EGC，没有发现 2,3-反式-黄烷-3- 醇产物 C 和 GC 的生成。 2. 进行了 CsANR1 和 CsANR2 的原核表达。利用钴离子亲和树脂，对 CsANR1 和 CsANR2 融合蛋白进行了分离纯化，得到目的蛋白。利用 C18 柱和旋光异构柱分 离，结合 HPLC 检测技术，对 CsANR1 和 CsANR2 融合蛋白进行酶活检测及产物鉴 定。结果显示，以 CYA 为底物时，重组 CsANR1 或 CsANR2 酶生成的主要产物 是（-）C 和（+）EC；以 DEL 为底物时，重组 CsANR1 或 CsANR2 酶生成的主 要产物是 EGC 和 GC。在 NADP+存在的条件下，没有检测到重组 CsANR 具有催化 （+）C 和（-）EC 之间相互的差向异构作用。 以上结果提示，来自茶树鲜叶的蛋白与原核表达的重组蛋白之间的酶反应产物并 不一致。 3、对重组 CsANR1 和 CsANR2 的酶学特性进行研究分析。结果表明，CsANR1 酶的最适反应温度为 40℃，最适 pH 值为 6.5；CsANR2 酶的最适反应温度为 40℃， 最适 pH 值为 5.5。从底物特异性结果看，CsANR1 酶以 CYA 为底物时的亲和力高 于 DEL，但 DEL 的 Kcat/Km 值却要高于 CYA；而 CsANR2 酶以 DEL 为底物时 的亲和力高于 CYA，且 DEL 的 Kcat/Km 值也高于 CYA。此外，大多数金属离子 对两种酶有抑制作用，特别是 Hg2+，在 1mM 的浓度下两种酶已完全失活。但 Al3+ II II 在 1mM 浓度下却对 CsANR1 酶有促进作用。另外，通过对酶的稳定性研究，可以 看出两种酶在低温下放置一段时间仍能保持较高的稳定性，在 pH 值 5.0-8.0 的缓 冲液下两种酶活都相对稳定。 以上结论丰富了茶树儿茶素及其原花青素合成及其调控机理。 关键词：茶树；花青素还原酶；原核表达；酶学特性 PAGE PAGE IV Abstract Catechins, as the main secondary metabolites in tea plant，is the main chemical component to determine the quality and health benefits of tea. Anthocyanidin reductase (ANR) is a key enzyme in the biosynthetic pathway of proanthocyanidins(PAs), which catalyzes anthocyanidins into the corresponding 2, 3-cis-flavan-3-ols.As a key enzyme in the biosynthetic pathway of proanthocyanidins (PAs). In this paper, we preliminary purified ANR protein from fresh tea leaves and carried out prokaryotic expression. Using HPLC technology, we compared the differences of reaction products between two sources of ANR protease.Secondly, we co