多能性干细胞诱导与体外培养的初步研究-养殖专业论文.docxVIP

2. 利用非整合 Episomal 质粒诱导耳聋病人体细胞获得多能性干细胞的 初步研究：探讨应用非整合质粒系统获得病人 iPS 细胞的可行性。结果显示： 病人皮肤组织块原代培养第 7 天，可观察到大量细胞从人耳皮肤组织边缘 向外延伸，呈典型的成纤维细胞特征。利用非整合 Episomal 质粒转染病人 耳皮肤成纤维细胞，电转后第 5 天能明显观察到细胞的形态由原先的梭形 慢慢变圆，第 15 天能观察到一个孔中已出现大量不规则的圆形或椭圆形扁 平状的细胞集落，能明显与集落周围的成纤维细胞区分开。取第 3 代次的 人 iPS 细胞进行碱性磷酸酶染色，可观察到细胞集落被染成深紫色，表现为 AP 阳性，而对照饲养层细胞则未被着色，呈 AP 阴性。以人胚胎干细胞 H9 作为阳性对照组，取第 3 代的人耳皮肤成纤维细胞诱导的 iPS 细胞，用小鼠、 大鼠、兔子来源的 OCT-4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1 抗体作为 一抗，经过免疫荧光染色后观察显示：人 iPS 细胞表达人胚胎多能性干细胞 细胞核蛋白 OCT-4、NANOG 以及细胞膜蛋白 SSEA-3、SSEA-4。未检测到 小鼠多能性干细胞特异性膜蛋白 SSEA-1 的表达。细胞用 Hochest33342 染 细胞核，观察到多能性核蛋白 OCT-4、NANOG 能与 Hochest33342 染的细 胞核重合；而多能性细胞细胞膜特异性表达的 SSEA-3、SSEA-4 分布在 Hochest33342 染的细胞核周围，呈网格状分布；未能在 iPS 克隆上观察到 小鼠多能性干细胞特异性的 SSEA-1 的表达。证明了本实验电转得到的 iPS 细胞来源于人耳皮肤成纤维细胞，并非小鼠胚胎成纤维细胞。 3．通过在 293T 细胞、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、人间充质干细胞 （ MSC ）、 人胚胎干细 胞 （人 ESC） 等 不同类型 细胞的培 养液中添 加 Selleckchem 公司生产的支原体去除试剂，最终确定该试剂的作用效果。 结论：以四个多潜能性转录因子 OSKM 为组合，用慢病毒载体比逆转 录病毒载体更容易诱导 P53 基因全敲型小鼠胚胎成纤维细胞为 iPS。通过非 整合 Episomal 载体转染的方法，可以获得耳聋病人体细胞来源的人 iPS， 为探讨应用 iPS 细胞对耳聋病人进行治疗性细胞移植研究奠定了基础。 关键词： 小鼠成纤维细胞 人耳皮肤成纤维细胞 体细胞重编程 诱导多 能性干细胞 支原体污染 THE STUDY OF PLURIPOTENT STEM CELL INDUCED AND CLUTURED IN VITRO ABSTRACT Induced pluripotent stem cells (iPSC) was originally developed by Japanese scientist Yamanaka,using a retrovirus carrying four transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, were induced into mouse fibroblast cells, obtained cell types similar to embryonic stem cells on properties. Using the patients own cells obtained iPSC can reduce the immunological rejection, and it can avoid ES cells facing ethical problem very well. So the iPS cells have a broad application prospect in the establishment of animal model, drug screening and treatment. To investigate the feasibility by iPS cells induced from deaf human cells,the contents of this thesis include the following three parts: Firstly, induced mouse embryonic fibroblasts with genetype of P53 knockout and wild-type by an inefficient system,and then analyzed the Dlk1 -Dio3 gene expression differences of