草鱼转录因子Runx1和Runx3的分离鉴定及其免疫功能研究-生物医学工程专业论文.docxVIP

摘要 摘要 I I 摘 要 Runt 相关转录因子（Runt-related transcription factor，Runx）是一个转录因子 家族。哺乳动物 Runx 家族包含 3 个成员：Runxl、Runx2 和 Runx3，它们在多种 生理活动中发挥了重要调节作用。其中 Runx1 和 Runx3 在免疫系统中的功能更令 人关注，主要参与调节免疫细胞的增殖、分化和功能等。目前，虽然斑马鱼和河 鲀的 Runx 家族成员及其辅助因子 CBFβ 已被克隆和鉴定，但是 Runx1 和 Runx3 在鱼类的免疫学功能还未知。本论文以草鱼为研究模型，首先鉴定了 Runx1、Runx3 及 CBFβ 的分子特征，然后提供它们参与免疫反应的证据，最后阐明它们的免疫调 节功能，特别是在介导转化生长因子 β（Transforming growth factor-β，TGF-β)调节 作用中的地位。研究内容如下： 1. 草鱼 Runx1 和 Runx3 的分离鉴定和诱导表达分析：（1）通过简并 PCR 和 RACE PCR 等多次 PCR 反应，克隆获得草鱼 Runx1 五种剪接体（Runx1 v1-5）和 Runx3 的 cDNA 序列。结构特征分析、氨基酸多序列比对及系统进化树分析证明 它们分别是哺乳动物的 Runx1 和 Runx3 的同源基因。（2）Runx1 的五种剪接体中， Runx1 v1-3 具有完整的功能结构域，包括转录活化结构域（transactivation domain， TAD)、抑制结构域（inhibitory domain，ID)、PY 模体及 C 末端 VWRPY 模体，而 Runx1 v4-5 缺乏 TAD、ID、PY 及 VWRPY 等功能结构域。组织分布检测发现 Runx1 v1-3 和 Runx1 v4-5 具有相似的组织分布特征，在胸腺中表达水平最高，其次是脾、 肾、头肾等组织，在外周血白细胞中表达较高；Runx3 在胸腺和脾中表达水平最高， 其次是外周血白细胞。（3）LPS 和 PHA 均能刺激草鱼外周血白细胞 Runx1 v1-3、 Runx1 v4-5 和 Runx3 基因表达上调，而 poly I:C 只对 Runx1 v1-3 和 Runx3 有诱导 作用。（4）嗜水气单胞杆菌感染促使草鱼 Runx1 v1-3 和 Runx3 在头肾、脾及胸腺 组织中的表达不同程度增强，而 Runx1 v4-5 的表达上调仅发生在脾和胸腺组织。 Runx1 v1-3 和 Runx1 v4-5 在体内外免疫刺激实验中呈现出不同的时间动力学特征， 说明它们的免疫功能可能存在差异；推测 Runx1 v4-5 可能作为一种天然存在的抑 制剂，调控硬骨鱼 Runx1 信号通路中过度的激活反应。 2. 草鱼 Runx 辅助因子 CBFβ 的分离鉴定和表达特征：（1）通过多种 PCR 技 术，分离获得草鱼 CBFβ 的 cDNA 序列；氨基酸多序列比对及系统进化树分析证 明它是哺乳动物 CBFβ 的同源基因。（2）3D 同源建模表明草鱼 CBFβ 的空间结构 与哺乳动物 CBFβ 的空间结构相似度极高；CBFβ 在结构上的高度保守性暗示了其 在进化过程中的功能保守性。（3）CBFβ 和 Runx1、Runx3 具有相似的组织分布特 II II 征，在胸腺中表达水平最高，其次是脾、头肾，在外周血白细胞中表达较高。（4） CBFβ 主要定位于细胞核，证明了其作为转录因子发挥功能的基本特性。（5）LPS、 PHA 和 poly I:C 均能刺激草鱼外周血白细胞 CBFβ 基因表达上调。（6）嗜水气单 胞杆菌感染草鱼后，CBFβ 基因在头肾、脾和胸腺组织中表达水平上调，进一步确 证 CBFβ 参与了硬骨鱼免疫反应。 3. 草鱼 Runx1 和 Runx3 的功能鉴定：（1）Runx1 五种剪接体和 Runx3 无需刺 激，即能够直接入核，证明它们作为转录因子发挥功能的基本特性。（2）进一步 探讨草鱼 Runx1 和 Runx3 对 T 细胞亚型的标志细胞因子和转录因子表达的影响。 采用 Runx1 抑制剂的研究发现：草鱼外周血白细胞中 LPS、PHA 和 poly I:C 诱导 草鱼细胞因子 IFN-?、IL-17A/F1 和 IL-17A/F2 基因的表达，这些刺激作用被阻断 Runx1 信号所抑制。但阻断 Runx1 信号并不影响 poly I:C 对转录因子 Foxp3 表达 的上调。（3）由于没有特异的 Runx3 抑制剂，采用过表达草鱼 Runx3 方法的结果 显示：在草鱼肾细胞系（Grass carp kindney cell lines，CIK）中，过表达草鱼 Runx3 上调转录因子 T-bet 的表达，