对虾白斑综合征病毒和黄头病毒等温扩增检测方法的建立及应用-临床兽医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意 学校保留 并向国家 有关部门 或机构送交 论文的复 印件和 电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 □ ，在 年解密后适用本版权书。 不保密 □ 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 万方数据 万方数据 对虾白斑综合征病毒和黄头病毒等温扩增检测 方法的建立及应用 The establishment and application of isothermal amplification techniques in detecting WSSV and YHV 学位论文完成时间： _ _ 指导教师签字： 答辩委员会签字： _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 上海海洋大学硕士学 上海海洋大学硕士学位论文 对虾白斑综合征病毒和黄头病毒等温扩增检测方法的 建立及应用 摘 要 近年来，水产业迅猛发展，已逐渐成为中国农业中发展较快的产业之一，在 全球水产总量中占有举足轻重的地位。但在我国水产养殖规模不断壮大的同时， 各种病害也随之而来。对虾养殖业作为我国海水养殖业的支柱产业之一，也深受 多种病害困扰，我国对虾养殖业每年因对虾病害流行造成的损失高达数十亿元。 利用灵敏、高效的病原检测技术加强对虾苗种或养殖期特定病原的定期检测被认 为是防控对虾病害流行的有效手段。等温扩增技术作为一种新兴的检测手段，已 经广泛应用于人类医学、动物卫生等相关病原检测中。为了加强两种重要对虾病 害——对虾白斑病（White spot disease，WSD）和黄头病（Yellow head disease， YHD）的防控，本研究分别建立了对虾白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、黄头病毒（Yellow head virus，YHV）的快速、高灵敏等温扩 增检测技术。 本研究根据对虾WSSV基因组的保守序列设计合成5条特异性引物，通过对 反应体系中的Mg2+、dNTPs等试剂组分和温度、时间等反应条件进行优化，建立 了WSSV的交叉引物等温扩增（cross priming amplification，CPA）检测方法，并 将该检测方法与WSSV的套式PCR、qPCR以及LAMP检测方法进行了比较。结果 显示，该CPA方法的最佳反应温度为63℃，反应时间为60min；对WSSV的最低 检测限为 10 copies/μL ， 灵 敏 度 高 于 套 式 PCR 检 测 方 法 的 最 低 检 测 限 100 copies/μL，并与 qPCR以及LAMP 有着相同的灵敏度。WSSV CPA检 测方法与 WSSV、IHHNV、HPV、TSV、YHV以及副溶血弧菌没有交叉反应。WSSV的CPA 检测方法比PCR更为简便、快速、灵敏，且无需昂贵的变温仪器，非常适于养殖 对虾病原的现场检测，本研究为对虾苗种、养殖期WSSV的灵敏、特异和快速检 测提供了新的方法。 本文还针对国内发现的黄头病毒的一种新株型YHV中国株（YHV-7）和YHV 泰国株(YHV-1)，建立了一种通用型一步式实时荧光定量反转录环介导等温扩增 方法（rRT-LAMP）。首先根据YHV中国株和YHV泰国株的共同保守序列，利用 Primer Explorer V3软件设计了6条引物，并对rRT-LAMP反应体系和反应温度等 条件进行了优化，同时制备RNA标准品并构建标准曲线，将建立的rRT-LAMP 检 测方法与 rRT-PCR 进行了比较分析。结果表明： 58 ℃ 保 温、 Mg2+ 终浓度 8 I mmol/L、dNTPs终浓度1.4 mmol/L是YHV的最适rRT-LAMP反应条件。该方法的 检测灵敏度为 100 copies/μL ，而本研究建立的 YHV rRT-PCR 的灵敏度为 100 copies/μL，YHV rRT-LAMP检测方法比rRT-PCR检测方法的灵敏度高出100倍， 该检测方法与TSV、