茶树叶部由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶及咖啡碱合成相关酶基因差异表达-茶学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 茶树叶片中的单萜烯醇和芳香族醇等挥发性组分主要是以糖苷形式存在，且以樱草 糖苷和葡萄糖苷为主。与这类糖苷的合成与水解相关的酶类主要有 β-樱草糖苷酶、β-木 糖苷酶、β-葡萄糖苷酶Ⅰ、β-葡萄糖苷酶Ⅱ和 β-葡萄糖基转移酶。糖苷水解释放出的挥 发性苷元，不仅是茶叶香气的物质基础，更参与茶树对病虫害的防御反应。研究茶树叶 片中由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶基因表达差异，将开阔我们认识茶树与环境关系 的新视野，为进一步揭示茶树抗病性机理提供依据，也为改善茶叶香气品质提供理论基 础。 咖啡碱作为茶叶中嘌呤类生物碱的主体成分，因其具有重要的药理作用而一直被人 们关注。然而咖啡碱与茶树生理抗性方面的研究却鲜有报道。现已有研究表明，咖啡碱 作为一种有效的抑菌物质，能有效抑制茶树常见致病菌的生长，可能参与茶树抵抗病菌 侵染的防御反应。研究真菌侵染下茶树叶片中咖啡碱合成相关酶基因表达差异，有利于 探明咖啡碱抑菌机理，进一步丰富茶树抗病性理论。 本文利用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术，选用 GAPDH 为参照基因，研究了 真菌侵染前后茶树叶片内源糖苷酶基因和咖啡碱合成相关酶基因的表达水平差异，以及 利用高效液相色谱法检测了真菌侵染后不同阶段茶树叶片中咖啡碱含量的变化。主要结 果如下： 内源糖苷酶的实时定量 PCR 结果表明，β-樱草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶Ⅰ、β-葡萄糖 苷酶Ⅱ、β-葡萄糖基转移酶的表达水平在供试的 3 个茶树品种中变化趋势基本一致，均 有不同程度的诱导上调。这些关键酶基因的表达上调可能预示着更多糖苷类香气前体的 积累和更大量挥发性苷元的释放，可能对增强茶树抗病性有一定的帮助。基因的诱导上 调多发生在染病初期，也提示轻度侵染可能刺激茶叶糖苷类香气前体的积累和挥发性苷 元的释放。 咖啡碱合成相关酶的实时定量 PCR 结果表明，TCS1、sAMS、TIDH 在 3 个供试茶 树品种中的表达趋势基本一致，TCS1 上调幅度显著，sAMS 上调较为明显，TIDH 则无 明显上调变化。TCS1 基因在咖啡碱生物合成途径中负责后两步甲基化，即催化 7-甲基 黄嘌呤→可可碱→咖啡碱这两步甲基化反应，sAMS 则是活化甲硫氨酸为腺苷甲硫氨酸， 为甲基化反应提供甲基来源，这些关键酶基因的表达水平上调，预示着咖啡碱生物合成 增加的可能性。 咖啡碱液相检测结果表明，舒茶早、多抗香 2 个品种中咖啡碱含量有相似起伏变化， 均表现为在染病初期先降低，中期增加，后期又降低的趋势。没有发现基因水平上表达 差异与生化水平上含量变化的一致性，分析原因可能是，从基因表达到咖啡碱相关酶的 活性变化，再到咖啡碱生物合成，需要一系列复杂的过程。咖啡碱最终含量是茶树代谢 II II 过程中多种因素综合影响的结果。 关键词：茶,病原真菌,糖苷酶,咖啡碱,实时荧光定量 PCR,表达差异分析 PAGE PAGE IV Abstract Glycosides are the main form of the volatiles such as monoterpene alcohols and aromatic alcohols in tea leaves, and most of glycosides are primeverosides and glucosides. Enzymes responsible for biosynthesis and hydrolysis of glycosides mainly include β-Primeverosidase, β-Xylosidase, β-GlucosidaseⅠ, β-GlucosidaseⅡ and β-Glucosyltransferase. The volatile aglycones released from glycosides hydrolysis are not only the material base of tea aroma, but also participate in the tea plant defense reaction to disease and pests. The analysis of differential gene expression of endogenous glycosidases induced by pathogenic fungi infection in tea leaves can widen our horizon of interactions between tea plant and nature, and support the further study of tea resista