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草鱼热休克蛋白Hsc70和Hsp70在免疫反应中不同基因表达、蛋白质合成和分泌的特征探讨-生物物理学专业论文
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独 创 性 声 明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得电子科技大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
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(保密的学位论文在解密后应遵守此规定)
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日期: 年 月 日
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摘 要
摘 要
我们克隆出草鱼两种 70kD 大小热休克蛋白:诱导性热休克蛋白(Hsp70)和 组成型热休克蛋白(Hsc70)。其中 Hsp70 cDNA 全序列为 2250 bp,开放阅读框为 1932 bp,而 Hsc70 cDNA 全序列为 2449 bp,开放阅读框为 1953 bp。组织分布结 果表明 Hsp70 和 Hsc70 在腮,肾,头肾和外周血淋巴细胞中有较高的表达。采用 外周血淋巴细胞为细胞模型,检测 LPS 对 Hsc70 和 Hsp70 mRNA 和蛋白水平的影响。 结果表明:LPS 以时间依赖和剂量依赖形式提高 Hsp70 mRNA 的表达,而对 Hsc70 则没有作用。胞内两者蛋白水平的表达显示与基因表达一致的特征。进一步研究 表明,在胞外可检测到 Hsp70 的分泌,而且 LPS 能抑制这一分泌作用,提示在 LPS 刺激的外周血淋巴细胞模型中,Hsp70 胞内蛋白的含量与胞外蛋白的分泌可能存在 一种动态平衡。为进一步研究胞外 Hsp70 蛋白功能,我们将草鱼 Hsp70 蛋白开放 阅读框克隆到 pET30a(+)载体上,构建(BL21(DE3)-pET30a(+))原核表达系统, 并通过镍亲和层析得到纯化样品(rgcHsp70)。实时 PCR 分析显示 rgcHsp70 能够 明显提高草鱼头肾白细胞中 TNF-???和 IL-1??mRNA 表达。上述结果不仅对 LPS 调 节 Hsp70 和 Hsc70 基因表达,蛋白质合成和分泌提出了新的观点,而且为进一步 研究 Hsp70 在硬骨鱼中的免疫学功能奠定了基础。
关键词:草鱼,诱导型热休克蛋白 Hsp70 和组成型热休克蛋白 Hsc70,LPS 刺激, 外周血淋巴细胞,重组草鱼诱导型热休克蛋白 rgcHsp70
I
ABSTRACT
ABSTRACT
Two cDNAs, encoding the stress-inducible 70-kDa heat shock protein (Hsp70) and the constitutively expressed 70-kDa heat shock cognate protein (Hsc70), were isolated from grass carp. The Hsp70 and Hsc70 cDNAs were 2250 bp and 2449 bp in length and contained 1932 bp and 1953 bp open reading frames, respectively. Tissue distribution results showed that Hsp70/Hsc70 was highly expressed in gill, kidney, head kidney and peripheral blood lymphocytes (PBLs). Using grass carp PBLs as a cell model, effects of lipopolysacharide (LPS) on the mRNA and protein levels of Hsp70/Hsc70 were examined. In this case, LPS increased mRNA expression of Hsp70 in a time- and dose-dependent manner, but had no effect on Hsc70 mRNA expression. In agreement with this, LPS was revealed to markedly elevate cellular Hsp70 but not Hsc70 content
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