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藏羚羊微卫星富集文库构建与引物筛选-生态学专业论文
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研究生签名: 导师签名: 日期
III
藏羚羊微卫星富集文库构建与引物筛选
中文摘要
本研究利用分子生物学技术进行了藏羚羊微卫星富集文库构建和引物筛选,
筛选出一套多态性较高的微卫星分子标记,为探讨藏羚羊种群间基因流以及遗传 多样性保持机制奠定了基础。
本文通过 FIASCO (Fast isolation by AFLP of sequences containing r epeats)法对青海、西藏、新疆三个地理单元的 4 只藏羚羊 DNA 样品(青海 118
号、132 号;西藏 14 号;新疆 62 号)进行微卫星富集文库的构建与引物开发。 将 4 只藏羚羊的基因组 DNA 等比例混合,经限制性内切酶 MseⅠ酶切获得 300-1 000bp DNA 片段,经接头连接和变性使 DNA 双链解成单链,使用 7 种生物素标记 的寡核苷酸探针(AG)12、(AC)12、(GC)12、(AT)12、(AAC)8、(TGC)8 和(AGT)8 与单链 DNA 片段中含有微卫星的序列进行杂交。根据生物素与链霉亲和素的亲和 性原理,用链霉亲和素包被的磁珠亲和捕捉含有微卫星序列的 DNA 片段。对富集 片段通过 PCR 扩增恢复成双链,纯化 PCR 产物连接到 HYPERLINK mailto:pCR@2.1 pCR@2.1 载体,DH5α感受 态细胞转化培养,通过菌液检测,将条带数等于 2 的阳性克隆进行测序分析。主 要研究结果如下:
1、以生物素标记的寡核苷酸探针(AG)12、(AC)12、(TGC)8、 (AGT)8、(AAC)8 构建 的藏羚羊微卫星富集文库,经载体连接和克隆转化,阳性克隆率分别为 50.7%、 40.7%、50%、41.6%、31.1%,说明构建的藏羚羊基因组微卫星富集文库为质量较 好的文库。
2、利用磁珠富集法共得到微卫星序列 144 个,重复次数范围为 5-39 次。所选择
的 7 种生物素探针中,未富集到(GC)n、(AT)n 类型的微卫星序列。
3、依据得到的微卫星序列,用 Primer 5 软件在线设计并合成引物 107 对,对 3 个地理单元(青海、新疆、西藏)的 24 个藏羚羊基因组 DNA 扩增,成功筛选出 22 个具有多态性的藏羚羊微卫星位点。
4、首次构建了藏羚羊基因组微卫星富集文库,并将部分序列提交至 GenBank
(GenBank Accession Number:KC422272-KC422315)。
关键词:藏羚羊,微卫星,富集文库,引物,多态性
IV
Microsatellite loci isolation using microsatellite- enriched libraries from Tibetan antelope
Abstract
To isolate a set of microsatellite primer-pairs, the microsatellite-enriched libraries of Tibetan antelope were constructed in this study. The results suggest these isolated microsatellites will be useful for studies involving gene flow, genetic diversity analysis and genetic structure within Tibetan antelope populations on the Qinghai-Tibetan Plateau (QTP).
Enriched microsatellite libraries for Tibetan Antelope were constructed using Fast isolation by AFLP of sequences containing repeats (FIASCO). Four DNA samples (No. 118 and No. 132 in Qinghai, No. 14 in Tibet, No. 62 in Xinjiang) collected from three geographical units we
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