酪氨酸酶粗提取分离纯化纯度鉴定及活性测定.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT1 成绩 西安交通大学实验报告 课 程： 实验 日期：2012年 月 日 专业班级： 组别 交报告日期：2102年 月 日 姓 名： 学号 报 告 退 发：（订正、重做） 同 组 者： 教师审批签字： 实验名称： 酪氨酸酶的粗提取、分离纯化、纯度鉴定及活性测定 实验目的： 1.自行查阅资料，选取原材料，设计合理的酪氨酸酶提取、分离、纯化鉴定以及活性测定的方案； 2.按照实验方案，自主进行实验并对实验方案进行评价和改进； 3.通过酪氨酸酶的分离过程，了解并熟悉生物工程下游分离工程的一些常规操作； 4.对实验结果进行总结，分析和汇总展示，培养分析问题和自我展示的能力。 实验原理： 酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物和微生物体内。与生物体黑色素的合成直接相关。近年来，有学者已经从各种植物中提取得到酪氨酸酶，如马铃薯，蘑菇，香蕉，苹果，桑叶以及香樟等。相关资料显示，L-多巴和邻苯二酚测定体系都说明香蕉，马铃薯及蘑菇中酪氨酸酶的活性较高。因此，本实验选取香蕉为实验原材料，通过简单的提取分离以及纯化，初步得到了酪氨酸酶的样品（溶液），并用邻苯二酚为底物对其活性做了定性鉴定。 酪氨酸酶的粗提取包括研磨（匀浆），过滤，离心，盐析和透析等过程。盐析蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象。随着溶液中离子强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。同时由于盐的水化作用使蛋白质表面的疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出来，增大了蛋白质表面的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。盐析的方法有Ks盐析法和β盐析法，前者是改变体系的离子强度，而后者的则通过改变温度和pH实现。由于蛋白质对离子强度的变化十分敏感，所以常采用Ks盐析法。常用的盐有硫酸铵等。通过查阅资料，本实验中采用饱和度为55%的硫酸铵进行酪氨酸酶的盐析沉淀。透析是一种膜分离的方法，利用的是浓度引起的自由扩散，在透析袋内盛放盐析后酪氨酸酶的溶解液，放入缓冲液内透析，目的是除去盐析过程带入的离子。透析袋在使用前一般需要进行预处理。 通过以上操作可得到酪氨酸酶的粗酶液。粗酶液需要进一步的分离纯化。离子交换色谱法是一种利用离子交换剂作为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。离子交换色谱法洗脱的方式有恒定洗脱，线性梯度洗脱和逐次洗脱的方式。使用离子交换色谱时，首先需要填充固定相，如果是干粉还需要溶胀，填充的色谱柱不能有气泡，否则会影响分离结果。上样前需要先用上样缓冲液平衡，上样后需要用有一定离子强度的洗脱液洗脱，获得蛋白质样品。 经离子交换色谱柱纯化后的样品还可以继续纯化。由于实验条件和时间的限制，本实验的纯化仅进行到离子交换色谱一级。对于纯化后的样品，首先需要对其纯度进行鉴定，纯度鉴定采用SDS（聚丙烯酰胺凝胶电泳）来验证。 由于邻苯二酚在酶和氧的条件下转变成邻苯醌的速率很快,故可测定邻苯二酚转变成邻苯醌的速率而测定酶的活性 (可用411nm处的吸光度对时间作图, 从所得的直线斜率求酶的活性)。实验设计的思路可以用如下流程图表示： 实验器材及材料： 冰箱，天平，匀浆器，纱布，烧杯（100ml，250ml，500ml各1个），试管20个，5810R离心机，精密pH试纸，透析袋（截留分子量8000-14000，宽20mm），镊子，电泳槽，梳子，电泳仪，小型摇床，大培养皿，电炉，手套，口罩，50ml离心管，涡旋仪，1.5ml ep管，量筒（10ml，100ml，500ml各一个），滤纸，移液枪（10μl，200μl，1000μl），枪头（1000μl，200μl，10μl），阴离子交换柱，离子交换色谱仪，Ultrospec 2100 pro 紫外可见分光光度计，石英比色皿； 实验原材料：香蕉2.5kg； pH7.5Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L）；硫酸铵（需要配成饱和溶液）；lmmoI/L EDTA-Na2, 2％碳酸氢钠；0.02mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.5）；30%凝胶储液，1.5mol/L Tris-HCL（pH8.8），1 mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%SDS，10%AP，TEMED，蒸馏水，2×样品溶解液，5×电泳缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，低分子蛋白marker，凡士林，邻苯二酚，L-DOPA，pH7.2的磷酸盐缓冲液