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实验六-淀粉酶的专一性和温度pH激动剂抑制剂对酶活性的影响
实验六 淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂
及抑制剂对酶活性的影响
实验类型:验证型
目的和要求
1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。
2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法;电热恒温水浴的使用。
3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。
原理
酶具有高度专一性,一种酶只能催化一种或一类底物发生反应,如淀粉酶只能水解淀粉,不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时,能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+,生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响,因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应,并以蔗糖等作对照,便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。
操作方法
一、唾液淀粉酶的收集与处理
1.制备唾液实验者先将痰咳尽,用自来水漱口,以清除口腔内食物残渣,再在口腔内含蒸馏水约15ml,并作咀嚼咕漱运动,3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内,过滤于小烧杯中备用,为与下面稀释唾液相区别,此称制备唾液。2.煮沸唾液取上述唾液约2ml,盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。3.稀释唾液调整唾液淀粉酶活性,使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下,作用5min,水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块,按下列步骤操作:①第1排每凹各加1滴制备唾液,12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴,用滴管采用抽吸法,由稀到浓(14→12)小心混匀各凹,勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中,剩余稀释唾液应全部放回原凹中。②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中,均加入4滴缓冲液(pH6.8),2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水,用①混匀法充分混匀,置37℃下5min。③在第2排各凹中加I液一滴,混匀,观察比较各凹颜色,以浅棕-红色对应的稀释倍数,用生理盐水稀释
二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察
(一)取试管3支编号,按下表1操作
表1? 唾液淀粉酶专一性的实验观察
??? 试剂??
试管
pH6.8缓冲液
1%淀粉溶液
1%蔗糖溶液
制备唾液
煮沸唾液
1
20滴
10滴
-
5滴
-
2
20滴
10滴
-
-
5滴
3
20滴
-
10滴
5滴
-
将上述各管混匀后,置37℃
(二)温度影响酶促反应的实验观察
1.取试管3支编号,按下表2操作:
表2? 温度影响酶促反应的实验观察
管号
试剂
1
2
3
1.pH6.8缓冲液
20滴
20滴
20滴
2.1%淀粉溶液
10滴
10滴
10滴
3.预热5min
37℃水浴
沸水浴
冰浴
4.直接加入稀释唾液,立即混匀、计时
5滴
5滴
5滴
5.保温10min
37℃水浴
沸水浴
冰浴
2.将一、二管移入冰水浴中,待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明温度对酶促反应的影响。
四、pH影响酶促反应的实验观察
1. 取试管3支编号,按下表3操作:
表3? pH影响酶促反应的实验观察
?
pH4.0缓冲液
pH6.8缓冲液
pH8.0缓冲液
1%淀粉溶液
稀释唾液
试管1
20滴
-
-
10滴
5滴
试管2
-
20滴
-
10滴
5滴
试管3
-
-
20滴
10滴
5滴
2.将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明pH
五、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察
1. 取试管4支编号,按下操作:
表4? 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察
?
pH 6.8
缓冲液
1%淀粉溶液
蒸馏水
0.9%NaCl
1%
CuSO4
1%Na2SO4
稀释唾液
1
20滴
10滴
10滴
-
-
-
5滴
2
20滴
10滴
-
10滴
-
-
5滴
3
20滴
10滴
-
-
10滴
-
5滴
4
20滴
10滴
-
-
-
10滴
5滴
2. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟 HYPERLINK / 怎么减肚子,然后每管加入碘液1滴,混匀后观各管颜色的区别,并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。
注意事项
1.反应试管应清洗干净,不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用;
2.使用混合唾液,或通过预试选出合适的唾液稀释度,效果更为显著。
试剂和器材
一、器材
1.滴管、烧杯、试管(架)及试管夹 。
2.恒温水浴箱与水浴锅。
3.脱脂棉、漏斗及纱布。
4.白瓷反应盘
二、试剂
1.1%淀粉? 称取淀粉1g, HYPERLINK / 岳阳家政加少量水调成糊状,加入煮沸的0.3%N
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