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柑橘碎叶病毒巢式RTPCR检测的方法建立及的应用 　　摘要：柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf vrus，CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之一。本研究在柑橘碎叶病毒一步法RT－PCR检测体系的基础上建立了CTLV的巢式RT－PCR检测方法，并对其检测灵敏度及特异性进行了分析。结果表明，该方法检测灵敏度比一步法RT－PCR至少提高100倍，检测模板总核酸的最低浓度约1.27μg?L-1，具有良好的特异性。在对142个田间样品、24个茎尖苗及20个接毒的腊斯克枳橙的检测中，巢式RT-PCR的CTLV检出率最高，为21.5％，比半巢式RT-PcR检出率高3.2％，比一步法RT―PCR检出率高2.1％。该方法灵敏度高，特异性强，适用于对无病毒苗木生产的监控和田间样品的快速检测。 　　关键词：柑橘碎叶病毒；巢式RT―PCR；检测技术 　　中图分类号：S666　文献标识码：A　文章编号：1009―9980(2011)03―458―05 　　 　　柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus，CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之一。CTLV在我国浙江、湖南、福建和广西等省的局部地区曾造成比较严重的危害。应用和推广无病毒柑橘苗木是CTLV防治的有效措施。目前，柑橘无病毒苗木三级繁育体系已在我国多个柑橘产区建立，无病毒苗木得到了大面积的推广。为保证种苗安全，必须对采穗母本树进行定期鉴定，并对感病毒良种进行脱毒处理。这必然要求快速、灵敏的病毒检测技术。 　　CTLV是发状病毒属(Capillovirus)正义单链RNA病毒，病毒粒子呈弯曲线状。大小约为600-700nm×15nm，基因组全长约6496 nt，5’端具帽子结构，3’端具Poly(A)尾巴。应用腊斯克枳橙作为指示植物进行鉴定是CTLV检测的常规手段之一，但其检测周期较长(1～2a)，并易受环境条件影响。血清学检测技术大大提高了CTLV的检测速度，在美国、日本等国得到广泛应用。Kawai等制备了CTLV单克隆抗体用于酶联免疫法检测。但抗体制备不易，检测灵敏度有待提高。随着分子生物学的发展，RT-PCR检测方法以其速度快、灵敏度高、特异性好等特点受到青睐。Magome等，Osvaldo等，Kirby等分别建立了RT-PCR检测体系。Hailstones等建立了CTLV的半巢式RT-PCR检测方法，较Kawai等酶联免疫法的灵敏度提高500倍以上。本课题组唐科志等对该体系进行了改进，并在无病毒苗木生产中开展了应用。刘科宏等进一步建立了CTLV的实时荧光PCR体系，其灵敏度比常规PCR方法提高了100倍，但由于该方法还存在适用范围、成本等弱势而未得到推广。研究表明我国可能是CTLV的起源地，因而不同地域或品种的分离物可能存在较大变异。在对我国CTLV的实际检测中，上述方法在检测灵敏度、检测范围上具有一定的局限性，我们旨在通过比较优化以往研究，建立更为灵敏、适用的CTLV检测方法。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1　毒源 　　所用CTLV毒源及其他柑橘病毒病毒源，均经过相应的指示植物鉴定，保存于中国农业科学院柑桔研究所网室内。 　　 　　1.2　引物 　　试验所用引物见表1，均由上海生工生物技术有限公司合成。 　　 　　1.3　总核酸抽提 　　按照周常勇等的方法提取样品总核酸。 　　 　　1.4　一步法RT-PCR 　　一步法RT-PCR反应体系总体积10μL，包括：2×PCR缓冲液5μL，10 mol?L-1上下游引物各0.5μL，50 mmol?L-1MgSO4 0.3μL，5U?μL-1RY／Taq酶(invitrogen公司)0.2μL，模板RNA 1μL，超纯水2.5μL。RT-PCR扩增条件为：42℃，30min；94℃，2min；94℃，20 s，54.5℃，20 s，72℃，45 s，40个循环；72℃10min。 　　 　　1.5　巢式RT-PCR 　　第1轮RT-PCR的反应体系及扩增条件同1.4的一步法，但采用30个循环。第2轮PCR扩增以第1轮RT-PCR产物为模板，并使用不同的内部引物对，反应体系总体积25μL，包括：10×PCR缓冲液2.5μL，10 mmol?L-1dNTP 0.8μL，50 mmol?L-1MgSO40.8μL，10mol?L-1引物各1μL，5U?μL-1Taq酶0.3μL，超纯水17.6μL，第1轮RT-PCR的反应产物1μL。PCR扩增条件为：94℃，2min；94℃，20 s，56℃，20 s，72℃，45 s，40个循环；72℃10 rain。 　　 　　2、结果与分析 　　 　　2.1　一步法RT-PCR 　　构建了6个引物组合用于