柑橘黄龙病菌侵染九里香不同的方法的研究.docVIP

柑橘黄龙病菌侵染九里香不同的方法的研究 　　摘要：采用不同的方法将柑橘黄龙病菌传染到九里香，运用Nested―PCR技术确认九里香是否感染黄龙病菌。结果表明，采用汁液摩擦、注射和挤压法，接种2个月后不能在几里香植株体内检测到黄龙病菌；黄龙病阳性接穗红江橙嫁接九里香能使黄龙病菌成功侵染九里香，但接穗不能抽芽。草地菟丝子和虫媒柑橘木虱都能成功从阳性植株体内将黄龙病菌传播至九里香。柑橘木虱传“菌”效率结果表明，木虱在红江橙阳性植株上取食1.5-2h就能携带黄龙病菌，病菌从柑橘木虱传到健康的九里香上最短需要12h，单头木虱带菌就能使九里香成功感染黄龙病菌。温度对病原的传播效率有较大影响，气温高于35℃或低于15℃时，介体昆虫活力差，传播病原的效率较低，0℃温度下木虱几乎不传播病原。40℃时昆虫死亡率高，活力差。 　　关键词：黄龙病菌；九里香；嫁接；草地菟丝子；柑橘木虱；传染 　　中图分类号：S66　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)02-268-05 　　 　　柑橘黄龙病是柑橘生产上的一种毁灭性病害。该病主要分布在亚洲和非洲等国家和地区，长期以来，我国广东、广西、福建、台湾等地发病严重，经济损失巨大；江西、浙汀、四川、湖南、贵州、云南等地也有发生。除我国发生外，该病还在南亚、东南亚、非洲东南部、阿拉伯半岛等地区流行，2004年巴西柑橘主产区圣保罗洲发现该病，2005年美国佛罗里达洲报道了该病发生。柑橘黄龙病严重威胁着世界柑橘产业。黄龙病菌是一种韧皮部杆菌，如今已能成功进行人工培养。可分为3个种：亚洲种其传媒昆虫为亚洲柑橘木虱，非洲种其传媒昆虫为非洲木虱、美洲种其传媒昆虫为亚洲木虱。柑橘黄龙病的传播途径主要有嫁接传播和木虱传播，木虱是黄龙病菌唯一的虫媒介体；另外在室内还能通过草地菟丝子传播。 　　九里香(Murrara paniculata)为芸香科(RM-taceae)九里香属(Murraya)植物，也是黄龙病虫媒介体柑橘木虱最喜食的植物之一，感染黄龙病后很少表现症状，为HLB菌(Cadidatusliberibacter)的隐症寄主。九里香作为柑橘黄龙病菌的抗性材料有必要对其做进一步的研究，在本实验所要解决的问题就是寻找让九里香快速感染黄龙病菌的途径以及最佳途径的效率测定。研究结果可为下一步从九里香上大规模筛选抗黄龙病相关基因奠定基础，并为柑橘木虱和黄龙病的发生和防治提供有价值的参考。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1材料 　　2008年10月从广东龙门市的果园收集具有典型黄龙病症状的柑橘枝条，选取经PCR检测为阳性的枝条嫁接在健康红江橙的实生苗上，置于广东省农业科学院果树研究所的日光温室内培养3个月以上，翌年元月再次检测嫁接红江橙的材料，确定为柑橘黄龙病菌亚洲种侵染的阳性材料，并作为柑橘木虱的取食来源。九里香材料：2009年2月采自广州市绿化道上的九里香的种子，用无菌土栽培，苗高10cm后作为实验材料。昆虫介体：柑橘木虱雌雄虫采自于广州市内九里香，成虫在防虫网室内培养后交配产卵、孵化后的1龄若虫即为无黄龙病菌的柑橘木虱，若虫转移到无病原感染的九里香苗上。4龄以上的若虫置于阳性植株上饲养20d后即为带黄龙病菌的柑橘木虱。田野菟丝子于2009年3月下旬采自于广东东莞，采用藤茎繁殖方法保存于温室里带黄龙病菌的阳性材料上。所有的接种实验均在温室里进行。 　　1.2不同传染方式的比较 　　1.2.1针刺、摩擦接种和挤压法 　　在气温为25℃左右的环境下进行。针刺：用微型注射器将含黄龙病菌的磷酸盐缓冲液注入九里香幼苗茎和叶，以不含病菌的缓冲液为对照。摩擦接种：取市售的砂纸，分成等份小块，对折形成棱，用砂纸的棱蘸取接种液在接种植株叶片上轻轻从棱的一端划到另一端。挤压：注射器的针筒装入黄龙病菌的磷酸盐缓冲液，然后直接按压叶片(不用针头)。2-3个月后用Nest-PCR进行检测。以下的检测方法均采用同样的方法。 　　1.2.2嫁接传染在气温为20℃左右的环境下进行。方法一：采用腹芽嫁接法和劈接法将1a生阳性枝条嫁接到2a生健康九里香实生苗上，或将接穗削成长方形贴在九里香的茎杆上。处理5株植株，接穗总数为30个。方法二：幼苗和2a生的实生苗与阳性材料进行靠接，尽量增大接合面的面积，处理5株植株。观察接穗的存活情况，对接穗保持绿色的植株进行取样。在温度高于25℃再进行1次重复嫁接，每10d取样1次进行检测。 　　1.2.3菟丝子传播在气温为20℃左右的环境下进行。菟丝子成功寄生九里香后，人工辅助菟丝子的茎缠绕阳性材料上。每10d取样1次进行检测。 　　1.2.4柑橘木虱传播将供试带黄龙病菌的柑橘木虱禁食2h饥饿处理后转移到健康的九里香实生苗上处理1-2周。取九里香样品进行检测。