梨属野生种质资源SRAP―PCR反应的体系优化的研究.docVIP

梨属野生种质资源SRAP―PCR反应的体系优化的研究 　　摘要：采用正交直观分析法和新复极差法对影响梨属野生种质资源SRAP-PCR反应的5种因素（Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶、模板DNA）4个水平进行优化筛选。结果表明，优化后的梨属SRAP-PCR反应体系为25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL，2.0 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，0.4 μmol/L引物，1.5 U Taq酶，60 ng模板DNA。 　　关键词：梨属；SRAP-PCR；正交直观分析法；新复极差法 　　中图分类号：S661.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）12-0007-04 　　目前相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）技术已在多种果树、蔬菜以及大田作物中得以使用，并以其多态性丰富、简单、易测序[1]等优点应用于遗传多样性分析[2]、遗传图谱构建[3]、亲缘关系分析、种质资源鉴定以及比较基因组学等诸多研究领域。 　　正交PCR试验是基于统计学原理，研究各影响因素不同水平间交互作用的一种方法[4]，具有均衡分散和整齐可比的特点，可以简便、快速地找到反应体系的最佳组合[5]。正交直观分析法正是基于PCR正交设计试验的一种结果判断方法，即根据扩增条带的明亮度、特异性及数量的多少进行不同的分数判断，分数越高则表明扩增效果越好。新复极差法（SSR）是方差分析的进一步分析，用于多种因素对某一结果影响的各个因素之间的显著性分析。 　　目前基于正交设计法的SRAP-PCR技术已在辣椒、石榴等物种的相关研究中得以应用[6，7]。本试验采用正交设计法对梨属野生种质资源SRAP-PCR反应体系进行优化，并通过正交直观分析法和新复极差法，更直观快速地找到梨属SRAP-PCR反应体系的最佳组合，以期为梨属野生种质资源的开发利用与保护提供基础技术支持。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　供试材料为秋子梨（Pyrus ussuriensis）、褐梨（Pyrus phaeocarpa）、河北梨（Pyrus hopeiensis）、杜梨（Pyrus betulaefolia）、崂山梨（Pyrus trilocularis）。4月中旬于山东崂山、蒙山等地采集用于提取DNA的幼叶样品，幼叶采集后硅胶干燥保存。 　　1.2试验方法 　　1.2.1试剂和仪器DNA扩增采用Bio-Rad PCR仪，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在北京六一WD-9403CS型紫外仪上采集图像。试验所用引物由TaKaRa合成；用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和Buffer均购自TaKaRa公司。 　　1.2.2样品基因组DNA的提取梨属样品基因组DNA的提取采用改良的CTAB法[8]。基因组DNA质量的检测采用琼脂糖凝胶电泳法和核酸蛋白分析仪。 　　1.2.3PCR反应体系的正交试验试验采用L16（45）正交表设计，对影响扩增结果的5因素进行4水平共16个组合的筛选，各体系模板均为秋子梨样品，所选引物为随机Me5/Em11（序列见表3）组合，PCR反应体系总体积设为25 μL，每组合按其浓度计算加样量，并包含10×PCR buffer 2.5 μL，不足部分用超纯水补足。试验各因素水平见表1，正交试验设计见表2。 　　PCR反应扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环5次；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次；72℃延伸7 min，4℃保存。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，20 μL上样，电压120 V电泳90 min，电泳缓冲液为1×TAE，经溴化乙锭（EB）染色后，在紫外仪上采集图像。 　　PCR扩增结果分析参照何正文等[9]的直观分析法，即对各组合扩增出来的条带分别进行分数判定，分数等级设为3、2、1、0分。判定评分后再参照王军[7]、刘萌芽[11]等的方法，运用新复极差法对试验数据进行分析。 　　1.2.4体系稳定性检测随机选用6对引物组合对褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨 4个野生种进行PCR扩增，经电泳观察结果。所用引物序列见表3。 　　2结果与分析 　　2.1基因组DNA电泳检测 　　由图1可知，梨属样品基因组DNA电泳检测 　　结果良好，条带清晰明亮。核酸蛋白分析仪检测结果显示，A260/A280值皆在1.80至2.00之间，说明该梨属样品基因组DNA提取纯度和浓度都较高，符合PCR试验的要求。 　　2.2SRAP-PCR反应体系优化结果 　　试验中正