抗肿瘤药物的筛选方法 ppt课件培训讲学.ppt

抗肿瘤药物筛选;中国每年新增肿瘤病人200万人，死亡130-170多万人左右，目前全国肿瘤患者总数约450万人，并以每年3%的速度递增。肿瘤已经成为中国公民的头号杀手，每年因恶性肿瘤而死亡的人口占到总死亡率的22%。;２００9年中国常见恶性肿瘤的死亡率;2. 肿瘤的治疗方法;3. 常用的化疗药物;化疗药物的主要不良反应;4. 天然产物与抗肿瘤药物 ;二、整体动物水平的筛选; 肿瘤移植方法：;给药及药效评价：;２. 实体瘤动物模型; 肿瘤移植方法：;给药及药效评价：;２）人癌异种移植模型; 肿瘤移植和给药方法：;阳性药;药效评价：;抗肿瘤谱;沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用 (Carcinogenesis, 2013, 34:1331);三、细胞水平的筛选;细胞株的选择;１. 抑制肿瘤细胞增殖实验;MTT 原理示意图;实验方法; 2）细胞传代 贴壁细胞生长3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3 min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养液中。 3）细胞计数 细胞计数板 ; 5）细胞接种 3000-10000细胞接种在96孔板，贴壁 24小时，或对数生长期 6）加药处理72 h（指定时间点） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小时 8）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的 甲臜 9）酶标仪测定OD值 ;结果处理：;A;Ｂ）磺酰罗丹明B （SRB）实验;方法： 类似于ＭＴＴ法，10-20%三氯乙酸固定1 h 后，加入0.5-1%ＳＲＢ染色30 min，洗去 染料，空气干燥后，加入10 mM Tris 溶解 后，5４0 nm测定光密度 结果处理：同ＭＴＴ法 ;Ｃ）细胞排染法（酞酚蓝）;细胞死亡率 （%）;２. 诱导肿瘤细胞分化实验;对照组;３. 诱导肿瘤细胞凋亡实验;;;B）DNA形态观察（Hoeschst333258） 原理： Hoeschst333258与DNA特异性结合发出蓝色荧光 方法：肿瘤细胞用Hoeschst333258染色后，在荧光显微镜下观察 结果：活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或细胞质内可见强荧光的颗粒状物质。;;C）染色体ＤＮＡ断裂测定; ;３）PI/Annexin-Ｖ-FITC双染色分析 ;正常细胞 Annexin-V (-) PI (-);PI/AnnexinV-FITC 双染激光共聚焦分析结果;Annexin-V-FITC;４. 抗肿瘤血管生成实验;１）血管内皮细胞体外筛选模型;２）鸡胚绒毛尿囊膜血管新生??型;;３）斑马鱼血管新生模型;方法：在96 孔板上用药物处理胚胎,通过血管内源　　　　 性碱性磷酸酶染色来显示血管,进而评价药　　　　物对血管生成的作用。 结果： ;５耐药性逆转实验;;2) 逆转肿瘤多药耐药性作用的药物筛选;Effect of NSC23925 to reverse drug resisitance in MDR cell lines; 用荧光酶标仪、荧光显微镜或流式细胞仪检测加药前后耐药细胞株内抗癌药多柔比星Dox的含量。;HepG/ADM Control;Rhm123累积实验;6. 抗肿瘤侵袭和迁移实验;１）粘附实验 　原理：将Matrigel铺在96孔板上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构，可以有效地在体外模拟肿瘤细胞的粘附过程。 方法：将Matrigel包被96孔板，过夜，将药物处理后的细胞接种在96孔板，1h后，弃去未粘附的细胞，加入MTT培养，测定吸光度。 结果：;2）细胞划痕实验（运动能力检测）;;Transwell技术;原理：肿瘤细胞在趋化因子的作用下可 穿透聚碳酸酯膜，从上室转移到下室，有些药物可抑制这种迁移。;;细胞侵袭能力实验;6.自噬实验;自噬过程;自噬的特征;自噬的检测;LC3-GFP;相关蛋白表达;四、酶水平的筛选;ＤＮＡ拓扑异构酶抑制剂筛选;方法：裂解细胞, 提取拓扑异构酶, 测定酶总量或酶活 性的变化, 在酶反应体系中，加入负超螺旋 pBR322 质粒DNA, TOPO 酶提液及不同浓度的药 物，温育30 min后，加入反应终止液，在琼脂糖 凝胶中电泳, 溴化乙锭染色紫外灯下观察。 结果：;端粒酶抑制剂筛选;方法：裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白含量，ＰＣＲ 　　　　扩增，凝胶电泳，银染色 结果：端粒是由短DNA 重复序列组成,而端粒酶的作