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基因工程原理与方法 艾宾浩斯遗忘曲线 基因工程(Gene engineering)是指在体外按既定的目的和方案，将某一目的基因片段，与载体DNA连接，构成DNA重组体，并将其导入到受体细胞中。重组体随细胞的繁殖而扩增，或同时进行目的基因的表达，产生特定的蛋白质或使受体细胞表现出新的的遗传性状。 　　　基因工程又称遗传工程 (Genetic engineering)，重组DNA (Recombinant DNA)技术，DNA克隆(DNA cloning)或分子克隆(Molecular cloning)技术。 　　　问题：不同来源、不同物种之间的基因之所以能重组，并按预计表现出一定的性状，其原因是什么？ First, restriction endonucleases cleave DNA at specific sequences to generate a set of smaller fragments. Second, the DNA fragment to be cloned can be isolated and joined to a suitable cloning vector using DNA ligase to seal the DNA molecules together. DNA Cloning: The Basics To clone means to make identical copies; it is a term that was once restricted to the procedure of isolating one cell from a larger population of cells, then allowing it to reproduce itself to generate many identical cells. In such a way, sufficient quantities of a single cell type were made available for study. By analogy, DNA cloning involves separating a specific gene or segment of DNA from its larger chromosome and attaching it to a small molecule of carrier DNA, then replicating this modified DNA thousands or even millions of times. The result is a selective amplification of that particular gene or DNA segment. 基因操作基础知识与常用技术 一、宿主与质粒 二、基因工程载体 三、质粒的提取 四、核酸琼脂糖凝胶电泳 五、基因工程中常用的工具酶 六、目的基因的获得（基因组与RNA的提取） 七、DNA的酶切、回收、 连接及重组基因的转化 七、基因克隆策略 八、重组DNA的鉴定 九、 DNA序列测定 十、重组蛋白的表达 大肠杆菌宿主菌 一、基因质粒载体 　　　基因工程载体有质粒、噬菌体、酵母质粒以及病毒载体。其中质粒载体是DNA最基本的运载工具，也是最早建立起来的基因载体系统，而其它工程载体的构建及应用均离不开质粒载体。 　　　质粒是细胞染色体外能独立复制的一种环状双链DNA分子，大小从1kb到200kb不等，广泛存在于多种细菌中，少数蓝藻、真菌和绿藻中也存在有质粒。基因质粒载体是从自然界中存在的质粒经改造后构建而来的，主要分为克隆载体和表达载体两种，而后者又可分为原核表达载体和真核表达载体。 质粒的性质 1、质粒的复制与拷贝数 严紧型质粒和松弛型质粒 目前常用质粒载体的复制子与拷贝数 质粒的性质 2、质粒的不亲和性 3、质粒的转移 接合型质粒(tra+)、非接合型质粒(tra-) 4、质粒的表型： 有的质粒赋于宿主细胞一定的生物性状，如抗性质粒(R质粒)、产大肠杆菌素的Col质粒、引起细菌接合的育性质粒(F质粒)、降解毒物的降解质粒。 R质粒的抗性有：氨苄青霉素(Ap or Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Km Kan)、四环素(Tet or Tc)和新霉素(Neo)等 构建质粒载体的条件 1、复制子与质粒的拷贝数 2、选择标记：抗性基因。基因工程载体用得最多的Amp抗性基因、其次是Kan抗性基因，还有少量