恶臭假单胞菌S16中尼古丁降解途径中关键基因的功能及特性研究-生物工程专业论文.docxVIP

Dissertation Submitted to Shanghai Jiao Tong University for the Degree of Master FUNCTION AND CHARACTERIZATION OF NOVEL GENES FROM PSEUDOMONAS PUTIDA S16 IN NICOTINE CATABOLISM Candidate： Wang Weiwei Student ID: 1120809075 Supervisor： Xu Ping Academic Degree Applied for： Master of Engineering Speciality： Bioengineering Affiliation： School of Life Science Biotechnology Date of Defence： Jan, 2015 Degree-Conferring-Institution： Shanghai Jiao Tong University 恶臭假单胞菌 S16 中尼古丁降解途径中关键基因的功能及 特性研究 摘要 中国已成为世界五大烟草生产国之首，每年消费世界上最多的烟草类制品。 约 25%的烟叶（梗）、烟末及未能用于烟草加工的废料等因其无法用于烟草生产 而丢弃，这些烟草废弃物中含有大量尼古丁，被认为是“有毒的危险废物”，不能 直接与生活垃圾一起处理，需经过预处理除去尼古丁等有毒化合物。尼古丁是一 种可水溶的神经毒性物质，亚硝化后可产生强制癌物质-尼古丁衍生物亚硝胺丁 酮类（如 NNK）。因此有效控制卷烟和环境中的尼古丁含量，对环境保护和人类 健康有着深远意义。 本文以一株能够高效降解尼古丁菌种-恶臭假单胞菌 S16 为研究对象，在基 因组和蛋白质组数据基础上，对以下 6 个基因 nicA1，hspA，pps_4076（mfs）， pps_4079(sapd)，pps_4080(pnao)及 pps_4081(nicA2)进行了荧光定量 PCR 分析， 发现 pps_4076（mfs），pps_4079(sapd)，pps_4080(pnao)及 pps_4081(nicA2)在尼古 丁诱导下转录量明显上调。 根据 RT-qPCR 数据，对尼古丁降解过程中 2 个关键酶尼古丁氧化酶 NicA2 和假氧化尼古丁氧化酶 Pnao 进行了定位与功能鉴定。菌株 S16 中 nicA2 基因和 pnao 基因敲除实验，分别验证了这两个基因在尼古丁降解过程中发挥了关键作 用。体外表达 NicA2 蛋白，发现其能催化尼古丁到假氧化尼古丁反应，证明 NicA2 为尼古丁氧化酶。休止细胞检测突变株 S16dpnao 催化尼古丁转化并积累假氧化 尼古丁，表明 Pnao 为直接作用于假氧化尼古丁的催化酶，敲除株回补实验验证 了 Pnao 功能。 关键词：恶臭假单胞菌 S16，尼古丁代谢，RT-PCR，尼古丁氧化酶 NicA2，假氧 化尼古丁氧化酶 Pnao I Function and characterization of novel genes from Pseudomonas putida S16 in nicotine catabolism ABSTRACT China is largest producer and consumer of tobacco in the world, with 1/3 proportion of the global tobal consumption. While, 25% of tobacco upper leaves, dust, and other wastes were discarded and upper tobacco leaves accumulated and formed an important source of tobacco waste. These wastes, with exceeding 0.05% (w/w) content of nicotine, have been classified as “toxic and hazardous” by European Union Regulations. As the contaminant in water, nicotine has potential harmful to environment and human if appropriate disposal of the toxic tobacco waste is not performed. Nicotine could be nitresated into highly carcinogen