凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基2种变体的克隆及其免疫学活性分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘 要 血蓝蛋白是近年来在对虾等无脊椎动物体内新发现的一种具有多种免疫活性的多功 能蛋白。有趣的是，课题组前期研究发现，凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基（命名为 HcL） 可能至少存在 42 条变体序列（命名为 HcLV），但迄今为止，大部分变体的全长序列及其 免疫学功能尚不清楚。为此，本研究在课题组前期已获得的 3 条变体序列（HcLV1-3)的 基础之上，进一步采用分子生物学、免疫学策略对另外两条差异较大的变体序列（HcLV4, HcLV5)进行了深入、系统的研究。所获主要研究结果如下： 1、2 种 HcLV 全长 cDNA 的克隆及序列分析 基于数据库中已知的 HcLV4、HcLV5 部分 EST 序列，采取 RACE 技术，克隆 HcLV4、 HcLV5 cDNA 全长序列，发现 HcLV4、HcLV5 cDNA ORF 框分别为 2219、2137 bp，编码 672、678 个氨基酸。经 BLAST 比对，HcLV4、HcLV5 氨基酸序列与 HcL 序列存在 90、 83％的相似性。两者均具有血蓝蛋白的典型结构，包括铜离子结合区域，保守 His 位点和 Ig-like 区等。该结果进一步证实了对虾血蓝蛋白变体的存在，为深入了解对虾血蓝蛋白的 免疫防御机制奠定了良好的基础。 2、2 种 HcLV DNA 序列的克隆及多态性分析 根据已知的 HcLV4、HcLV5 cDNA 全长序列，扩增 HcLV4、HcLV5 DNA 序列，获得 HcLV4 DNA 5’ 端序列及 HcLV5 DNA 全长序列，HcLV4 5’ 端 DNA 全长 952 bp，无内含 子区域，其与 HcLV4 cDNA 序列同源性为 99%；HcLV5 DNA 全长 2660 bp，其中含有 2 个内含子区域，分别位于 80-538 bp 处（命名为 gHcLV5-I-1）和 2064-2227 bp 处，其外显 子区域与 HcLV5 cDNA 序列同源性为 99%。 在此基础之上，采用文库构建、核酸测序与序列比对等技术进一步对 gHcLV5-I-1 的 多态性进行了进一步的研究。结果发现，该内含子区域具有明显的分子多态性，且不同组 织之间存在组织差异性，根据其序列变化规律，所测序列可进一步分为 3 种亚型。进化 分析显示，该 3 种亚型序列可能通过缺失突变、点突变等基因突变方式演化而来。由此说 明，对虾血蓝蛋白大亚基变体序列的多态性来源于其 DNA 水平，且其内含子同样具有高 度的分子多态性。 3、1 种 HcLV 的原核表达及其免疫学功能研究 采用原核表达、凝集实验、抑菌实验、RNAi、免疫刺激等技术进一步对 HcLV4 的免 I 疫学功能进行了进一步的探索。结果发现，HcLV4 重组表达蛋白（命名为 rHcLV4）分子 量为 96.3 kDa，与预期大小一致，其对副溶血弧菌等 3 种细菌具有明显的凝集活性，其凝 集活性大小为 31.25-500 μg/ml，约为 HcL 重组表达蛋白（rHcL）的 2-8 倍；与 rHcL 一 致，rHcLV4 对副溶血弧菌同样具有抑菌活性，且将其注射对虾后，可显著降低对虾感染 副溶血弧菌之后的死亡率；不过，与预期不一致的是，HcLV4 基因被 RNAi 后，对虾感 染副溶血弧菌后的死亡率非但没有升高反而明显降低。由此说明，对虾血蓝蛋白变体 （HcLV4）在对虾免疫防御中同样具有重要的免疫学功能。 综上所述，本研究成功克隆得到两条对虾血蓝蛋白大亚基变体 HcLV4，HcLV5 的核 酸序列，其与对虾抵御病原微生物密切相关。所获研究结果，对丰富对虾血蓝蛋白的分子 多态性研究，深入揭示血蓝蛋白功能多样性的分子机制，阐明对虾免疫防御机制等具有重 要的意义。同时，为选育抗逆优良对虾品种、建立对虾病害的免疫学防治方法等提供了良 好的科学依据，促进对虾养殖业的健康、持续发展。 关键词：凡纳滨对虾，血蓝蛋白大亚基，变体，多态性，免疫 II Abstract Recent reports reveal that hemocyanin in shrimp and other invertebrates is a novel multifunctional protein with several immunological activities. Interestingly, we lately found that there might exist 42 variants of hemocyanin subunit with higher molecular weight (Named as HcL) in shrimp Litopenaeus vannamei (Named as HcLV). Wherease un