胃癌胰岛素样生长因子-2基因的印迹状态的检测0522-1.pptVIP

2. 按以下条件进行PCR反应 94?C 5 min 1个循环 94?C 45 sec 30个循环 55?C 45 sec 72?C 45 sec 72?C 7 min 延伸 实验四 限制性酶切及电泳检测 一、限制性酶切 【基本原理】 SNP的存在导致限制性酶切位点发生改变。 根据IGF2基因第9外显子具有限制性核酸内切酶ApaI位点多态性的特点，RT-PCR产物行ApaI消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行印迹丢失检测。 限制性内切核酸酶(restriction endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出一百多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 限制酶的命名 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoR I来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株, I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。 ?  如：Hae Ⅲ 5’-GGCC-3’ ? Bam H I 5’-GGATCC-3’ 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差; 　　 粘性末端（sticky end）交错切,产生短的互补 单链末端。 用途 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途： 1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 2) Gene突变（点突变）可引起酶切位点的消失或新的酶切位点的出现。因此个体间酶切片段长度会有差异——限制性片段多态性分析。 【器材】 1．恒温水浴箱；2．EP 管；3．手套 【试剂】 1．ApaI限制性内切酶；2．10×L buffer； 3.纯水 【操作步骤】 ApaI 2 ul 10×L buffer 4 ul 水 24ul PCR产物 10 ul 总反应体系 40 ul RT-PCR产物酶切体系： 37℃水浴摇床过夜 1.限制性内切酶消化 2. 电泳检测 酶切产物10 ul与电泳上样缓冲液充分混合，在40mA电流 下，1-2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察杂合子情况。 一、琼脂糖凝胶电泳 【基本原理】 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片段的常用方法。 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。对于线性 DNA 分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。 在凝胶中加入少量溴化乙锭 (EB)，其分子可插入 DNA的碱基之间，因此可在紫外灯下直接观察到 DNA 片段在凝胶上的位置，并可在紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。 线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系 琼脂糖凝胶的百分浓度（%） 线状DNA分子的有效范围（Kb） 0.3 60～5 0.6 20～1 0.7 10～0.8 0.9 7～0.5 1.2 6～0.4 1.5 4～0.2 2.0 3～0.1 【器材】 1．水平电泳槽；2．电泳仪；3．紫外透射仪或凝胶成像系统 【试剂】 1．1% 琼脂糖；2．电泳缓冲液 (1×TBE)；3．10 mg/ml 溴化乙锭 (EB)； 4．电泳样品上样缓冲液 (6×)：0