四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究..doc

四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究 ：周永列，吕亚萍，胡惟孝，邱莲女，王文松，吴 建国，刘建栋 】为了观察四嗪二甲酰胺是一种咪唑四嗪类口 服抗肿瘤药，属于不对称四嗪类化合物。四嗪二甲酰胺 (ZGDHu-l)是一种新颖的对称四嗪化合物，是胡维孝等［1，2］ 改进了合成方法而设计并合成的经结构多种修饰的3，6-二 甲基-1，4二氢-1，2, 4，5-四嗪类化合物。经药物构效学 筛选，其中ZGDHu-l具有较强的抗肿瘤作用［3］，有望成为 一种具有自主知识产权的抗癌新药。为了研究ZGDHu-l抗血 液肿瘤的作用及其作用途径，我们以急性早幼粒细胞白血病 细胞株NB4为模型，体外观察了 ZGDHu-l对NB4增殖、分化 和凋亡的作用，并探讨其作用的分子机制。 材料和方法 材料 ZGDHu-l由浙江工业大学药学院制药工程研究所合成， 系白色片状结晶。用二甲亚砜溶解配制贮存液，浓度为 lmg/ml,应用液用含10%的小牛血清的RPMI1640配制。二甲 亚讽、p塞哩蓝、蛋白酶K、TPA、全反式维甲酸为Sigma公司 产品；NB T购自Fluck公司；DNA-Pre pkit (内含透膜剂，RNase 和 P I)为美国 Beckman-Coult er 公司产品；Annexin-V和 P I试剂系BenderMedSyste ms公司产品；bcl-2单克隆抗体， bax单克隆抗体及用于bcl-2, b ax检测的透膜剂、⑶lib、 CD1 3及同型对照均系法国Immunote ch公司产品。 Hoechst3325 8试剂系CalBiochem公司产品。PE标记的鱗酸 化P38MAPK单克隆抗体和磷酸化STAT3单克隆抗体购自 Bioscience公司；hTER T-mRNA实时荧光定量PCR试剂盒由 Roche公司提供。 细胞培养 NB4细胞株引自浙江大学血液病研究所。采用含10%的 小牛血清的RPMI 1 640并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸及青霉 素和链霉素(100 u g/ml)的培养体系培养。培养环境为 37°C、5%的C02培养箱。取对数生长期的细胞进行实验。 细胞活率、细胞计数和形态观察 以2X105/ml的细胞浓度，分别接种于含9种浓度不同 的ZGDHu-1的培养液中，并设10 u g/ml的ATRA作为阳性对 照组和不加药物的空白对照组，每瓶含5ml。培养24、48和 72小时，计数各组细胞数，计算细胞增殖抑制率，用4%台盼 蓝染色，计数活细胞数。每次每瓶计数3次，实验重复3次， 绘制细胞增殖和活力曲线。取药物作用后各组的细胞先在倒 置显微镜下观察，再将细胞悬液离心涂片，用Wright-G iemsa 染色，光镜下观察细胞形态变化。 ZGDHu-1对NB4细胞生长影响的MTT测定 调整细胞浓度为5X104/ml，接种于96孔无菌培养板中， 每孔200 Pl。实验组、阳性对照组和空白组的设置同细胞活 率和计数测定。每组每个浓度下设3个复孔，实验重复3次。 培养24、48和72小时后用MTT法读取吸光度值，计算抑制 率并绘制剂量效应曲线，求出Z⑶Hu-1对NB4细胞的半数抑 制浓度(IC50)。 凋亡细胞的AnnexinV/PI标记染色测定 调整细胞浓度2X105/m 1的，分别接种于含6种不同 ZGDHu-1浓度的培养液中，并设10 P g/ml的ATRA作为阳 性对照组和不加药物的空白对照组，每瓶含5ml。培养1 2 小时后轻轻收获细胞1X106个，用冷PBS洗1遍后置0°C水 浴中，力P 49 0 u 1结合缓冲液，轻轻混匀后加5 u 1 HTC-AnnexinV和5 ul PI, 10分钟后用流式细胞仪 检测。 细胞周期和DNA倍体分析 分组方法同AnnexinV/PI标记，培养48小时后，取培 养细胞悬液ml,用冷PBS各洗涤1次，加DNA-Pr epkit中 透膜液50 Pl，轻摇后放置1分钟，加碘化丙锭染液500 u 1作用15分钟后，在EPICS-XL型流式细胞仪上分析，检测 104以上个细胞，并用Muticycle软件进行D NA倍体及细胞 周期分析，计算亚二倍体峰(subGl)的百分率。 DNA琼脂糖凝胶电泳 收获经ZGDHu-1作用48小时的NB4细胞IX 107个，用 SDS和蛋白酶K裂解细胞后，按照常规方法用酚一氯仿提取 DNA,复溶于TE缓冲液中，经溴乙锭染色后，用15g/L琼 脂糖凝胶电泳，5 V/cm，电泳3-4小时，在紫外线透射仪上 显影拍照。 NBT还原试验 取经ZGDHu-1作用后的NB4细胞500 P 1，与2g/L的NBT 溶液混合，加入lOOwg/mlTPAlOul，37°C孵育30分钟后离 心涂片，光学显微镜下观察胞浆内含蓝灰色颗粒的阳性细胞 计数2 00个