浙江省急性腹泻患儿中肠道病毒检测分析的研究.docVIP

浙江省急性腹泻患儿中肠道病毒检测分析的研究 　　[摘要] 目的 探讨浙江省急性腹泻患儿的常见病毒组成。 方法 采集5岁以下（≤5岁）急性腹泻患儿的811份粪便标本，采用ELISA方法检测A组轮状病毒（RV），应用多重PCR方法同时检测B/C组RV、诺如病毒（NoV）、札如病毒（SaV）、肠道腺病毒（AdV）、星状病毒（AstV），并利用RT-PCR对RV的阳性标本进行G、P分型。结果 811份粪便样本中，RV、NoV、SaV、AdV 及AstV总的阳性比例分别为25.52%、18.37%、4.44%、2.71%和1.23%；65份（8.01%）混合感染标本中以RV和NoV混合感染所占比例最大（56.92%）； 116份RV的G/P分型中，G3型（37.93%）、G1型（32.75%）和P[8]型（57.76%）是RV的优势型别，且G3/P[8]（27.59%）是混合感染最主要的组合。结论 浙江省五种常见腹泻病毒及其混合感染的流行状况，为临床治疗和疾病监测提供参考价值。 　　[关键词] 肠道病毒；急性腹泻；混合感染 　　[中图分类号] R725.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）12-0109-05 　　急性腹泻是世界范围内的一个不容忽略的公共卫生问题，在发展中国家，每年共有两百万人的死亡与急性腹泻有关，其中主要是婴幼儿[1]。随着抗生素的广泛应用，加之人们卫生习惯的改善，细菌性腹泻和寄生虫性腹泻感染已有所降低[2]，但是病毒性腹泻没有得到有效的控制。轮状病毒（Rotavirus，RV）、诺如病毒（Norovirus，NoV）、札如病毒（Sapovirus，SaV）、肠道腺病毒（Adenovirus，AdV）、星状病毒（Astrovirus，AstV）是引起婴幼儿病毒性腹泻最主要的五种病原[3]。本研究的目的是了解浙江省5岁以下门诊腹泻患儿中五种常见病毒以及混合感染的分布情况，为我国的病毒性腹泻的防控工作提供有价值的流行病学和临床治疗的数据支持。 　　1 材料与方法 　　1.1资料来源 　　本研究选取浙江省5家医院作为监测哨点（浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、浙江大学医学院附属第一医院北仑分院、湖州市中心医院和浙江中医药大学附属第一医院）。随机收集2010年1～12月期间5家哨点医院门诊病例中5岁以下（含5岁）急性腹泻患儿的粪便标本811份。标本采集对象均符合每日排便3次或以上，且大便性状有改变（呈水样便、稀便）。每个患者只采集一份粪便标本，标本采集时间覆盖全年各月，每周均有采集；在进行核酸提取之前，所有标本都储存在-80℃。 　　1.2核酸的提取 　　将粪便标本在标本处理液（PBS液）中按1：10比例稀释后，再以8 000转/min离心5 min，最后留取上清液于-20℃待测。取200～400 μL处理好的粪便标本上清液，使用台湾Geneaid 公司生产的商品化核酸提取试剂盒（货号：VR100）对标本上清液进行核酸提取，操作方法详见试剂盒说明书。 　　1.3检测方法 　　1.3.1 A组轮状病毒检测及其G、P基因分型 采用DAKO轮状病毒ELISA检测试剂盒检测粪便上清液中的A组轮状病毒，操作步骤详见试剂盒说明书。对A组轮状病毒阳性的标本进一步采用一个两步扩增的逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行G、P基因分型，方法同以前研究[4]。G基因分型在第一步扩增中使用Beg9 （forward）/End9 （reverse）作为一对引物扩增出一条1 062 bp的基因片段，该片段在第二步扩增体系中作为鉴定G1、G2、G3、G4、G8和 G9型别的模板；P基因分型中第一步扩增中则使用一个引物对-Con3/Con2扩增一条876 bp的基因片段，作为第二步扩增的模板，鉴定P[4]、P[6]、P[8]、P[9]和P[10]。 　　1.3.2 B/C组轮状病毒、诺如病毒（GI和GII）、札如病毒、肠道腺病毒、星状病毒多重PCR检测 将提取的病毒核酸应用随机引物（NO： C1181， Promega， USA）合成病毒cDNA，条件为50℃逆转录1 h，99℃灭活逆转录酶5 min后，然后迅速放入冰内冷却。然后以合成的cDNA为模板，进行B/C组轮状病毒、诺如病毒（GI和GII）、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的多重PCR检测。多重PCR在25μL反应体系中进行，包括10×Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，5 U/μLTaq DNA聚合酶0.125 μL，7对病毒特异性引物（表1）（各33 μmol/L，0.2 μL）的混合物，模板核酸（除肠道腺病毒为DNA，其他均