植物生物工程实验二(植物DN的提取).ppt

植物生物工程实验 植物DNA提取、质量检测 及特定基因片段操作 实验目的 了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤 掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法 掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法 了解PCR原理，熟悉操作步骤 掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法 实验原理（DNA提取） 保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等 DNA存在部位 主要存在于细胞核中，线粒体和叶绿体中也少量存在 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来. CTAB法原理 SDS法 原理 SDS 阴离子去垢剂 高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA 基因组DNA 新鲜材料，低温保存 细胞培养时间不能过长 基因组DNA 材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 培养细胞－－蛋白酶K DNA质量检测 紫外分光光度计检测法嘌呤和嘧啶的母环含有共轭双键，因此也有紫外吸收现象，且在260nm和280nm处也存在吸收峰。蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波长下也会发生光吸收。因此，通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度 A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。 琼脂糖电泳 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作 根据OD260定量： 測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下： a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml c. oligonucleotide = 33 mg/ml PCR实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 起始 解旋 引物酶结合 延伸 连接 终止 仪器药品 1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；1000ul吸头（盒）；200ul吸头（盒）；10ul吸头（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；试剂瓶；量筒 恒温水浴锅；高速离心机；紫外分光光度计；电泳仪；电泳槽；酸度计；电子天平；PCR仪 CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；琼脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB 实验步骤 试剂配制 异丙醇；70%乙醇；90%乙醇