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Sephadex G-25凝胶层析引言层析技术分离纯化生物大分子利用那些物理化学性质上的差异？血红蛋白的相对分子质量与核黄素的相对分子质量差异很大，采用什么技术分离它们？ 采用该技术分离血红蛋白与核黄素需要到 哪些实验器材与试剂？ 实验目的（1）掌握凝胶层析的原理（2）掌握柱层析的基本装置（3）熟悉凝胶层析的操作过程 常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、分配层析。 本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同这种原理特性来分离混合物。实验原理 凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒，颗粒内部不是实心的，而是呈三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网孔结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢，比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。 原理示意图 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中实验器材与试剂（一）器材 1.2cm×40cm层析柱、1mL微量可调式移液器、721E型分光光度计、恒压贮液瓶、自动部分收集器（二）试剂 （1）葡聚糖凝胶Sephadex G-25 （2）血红蛋白与核黄素的混合液 （3） 洗脱液：0.05mol /L磷酸缓冲液 （pH=7.3）或生理盐水操作流程 凝胶处理 ↓ 层析柱的预备↓ 装柱↓平衡↓加样与洗脱↓收集与测定实验操作（1）凝胶处理。将Sephadex G-25凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶在静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。（2）层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。固定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡，待气泡排出后，使溶液在底部留至3 ~5cm高即关闭出水口。（3）装柱。将处理好的凝胶在烧杯内用体积的洗脱液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开底端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝胶沉积至25cm高度为止。（4）平衡。装好后，使层析床稳定5~10min，然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速为1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳定。（5）加样与洗脱。打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内溶液流至与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5mL样品的加样滴管在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后，打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面，然后将洗脱液加至距床表面2~3cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始洗脱。（6）收集与测定。收集时可用自动部分收集器或手工操作，每管接洗脱液3mL，直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对每管收集液进行光吸收测定。以收集管数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。注意事项（1）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。（2）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。思考题（1）说明凝胶层析的原理（2）层析柱中的“纹路” 、气泡和凹凸不平的床表面对层析效果有何影响？（3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导管，有防止层析床液体流干的作用，说明其原理。（4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？谢谢观赏