糖网明目颗粒对糖尿病大鼠视网膜病变防治的作用及机制的研究.docVIP

糖网明目颗粒对糖尿病大鼠视网膜病变防治的作用及机制的研究 　　摘要：目的 探讨糖网明目颗粒新工艺提取物防治糖尿病视网膜病变的作用机制。方法 改进传统水煎煮中药制备工艺，优选提取制备新工艺，采用高效液相色谱法检测2种工艺糖网明目颗粒提取物有效成分的含量；建立体内外药效学评价模型，评价药物作用效果。体外实验采用MTT法观察2种工艺不同浓度的糖网明目颗粒提取物对人脐静脉内皮细胞EA.hy 926增殖作用的影响。体内实验采用视网膜铺片及ELISA观察2种工艺糖网明目颗粒提取物对STZ造模制备的糖尿病大鼠视网膜微血管病变及其相关因子的影响。结果 与传统工艺比较，糖网明目颗粒新工艺提取物所含有效成分明显提高；糖网明目颗粒新工艺提取物能够明显改善糖尿病大鼠视网膜微血管病理学状态，降低血管生成相关因子的蛋白水平。结论 新工艺能够最大限度地提取和富集糖网明目颗粒中有效成分；新工艺提取物能够明显改善糖尿病大鼠视网膜微血管病理状态，其作用机制可能与调节血管细胞黏附分子及炎性因子有关。 　　关键词：糖网明目颗粒；糖尿病视网膜病变；人脐静脉内皮细胞；黏附分子；炎性因子；大鼠 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0062-05 　　基金项目：北京市科技计划“十病十药”中药专项（Z121102001112007） 　　通讯作者：连增林，E-mail：zenglinlian@ 　　糖网明目颗粒是基于中国中医科学院眼科医院高健生教授治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的临床经验方（密蒙花方）开发的中药6类新药。密蒙花方是在交泰丸的基础上加密蒙花、黄芪、女贞子、乌梅、益母草而成，具有补气助阳、养阴清热、通络明目作用。主治早期DR，症见视物疲劳、视力减弱、自汗、手脚凉麻、疼痛、大便干燥、尿频等。20余年临床实践表明，该方对提高DR患者的视力、改变视疲劳等临床症状及改善眼底血管状态均有明显效果[1-2]。本研究对上述处方传统水煎煮工艺进行了改进和优化，采用DR大鼠模型及体外细胞模型对2种工艺进行药效评估，并在此基础上探讨该药防治DR的作用机制。 　　1 实验材料 　　1.1 动物与细胞 　　SD大鼠，SPF级，7周龄，雄性，体质量180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院中药研究所中药安全评价中心。饲养环境：温度20 ℃，照明时间12 h，昼夜交替。人脐静脉内皮细胞EA.hy 926购于中国科学院上海细胞库。 　　1.2 药物 　　糖网明目颗粒处方饮片（由女贞子、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂、黄芪、益母草组成），购于安国市萌露中药饮片有限公司，经北京汉典中医研究院刘晔鉴定为真品。糖网明目颗粒传统工艺及新工艺提取物由北京汉典中医研究院提供，采取醇提、水提相结合的方法，将各药材中的主要药效物质充分提取，最后经喷雾干燥制成提取物。 　　1.3 试剂 　　胎牛血清（FBS，Hyclone，SH30070.03），高糖DMEM培养液（Hyclone，SH30022.01B），0.25%胰蛋白酶（Hyclone，SH30042.01B），DMSO（Amresco，0231），青链霉素混合液（Solarbio，P1400-100），MTT（Amresco， 0793-1g）。链脲佐菌素（STZ，Sigma，S0130-1G），ELISA试剂盒（北京鑫方程生物技术有限公司）。 　　标准品：蒙花苷（批号111528-201107）、盐酸小檗碱（批号110713-201212）、桂皮醛（批号110710- 201217）、黄芪甲苷（批号110781-200613）、特女贞苷（批号111926-201203）、盐酸益母草碱（批号111823- 201202）、齐墩果酸（批号110709-201206）、熊果酸（批号110742-201220），购于中国食品药品检定研究院。 　　1.4 仪器 　　高效液相色谱仪（Agilent 1260），YT-CJ-2ND型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司），MCO- 175二氧化碳培养箱（SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），MULTLSKAN MK3酶标仪（Thermo），DPL-ⅡA型喷雾制粒仪（重庆精工制药机械有限责任公司），LXJ-ⅡA型离心机（上海安亭科学仪器厂）。 　　2 实验方法 　　2.1 有效成分含量测定 　　传统工艺和新工艺制备的喷雾颗粒剂，经提取、纯化，采用高效液相色谱法（HPLC）检测，方法参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）[3]相关标准。 　　2.2 EA.hy 926细胞增殖检测 　　采