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结缕草根际联合固氮菌培养条件的研究 　　摘要: 以结缕草根际土壤中筛选得到的5株联合固氮菌为试验材料，对其培养条件以及典型生长曲线开展研究。结果表明，菌株在10～45 ℃均可生长，最适生长温度在20～30 ℃；最适生长初始pH值在7.0～7.5；菌株N4、N5、N6、N8的最佳通气量为220 mL，菌株N1最佳通气量为200 mL；并在上述基础上经过进一步试验得到了菌株的典型生长曲线。试验数据对于了解掌握菌株的生长规律以及作为生物菌肥加以利用具有重要的意义。 　　关键词： 结缕草；联合固氮菌；培养条件；典型生长曲线 　　中图分类号： Q 93-335文献标识码： A文章编号： 1009-5500(2011)05-0065-04 　　 　　联合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根际土壤中形成的特殊固氮作用,它们对植物生长有着一定的促进作用[1]。目前，水稻、玉米等禾本科作物根际固氮菌的研究较深入[2-13]，对于禾本科牧草固氮菌的研究较少。而近年来，草坪业在我国作为新兴产业,其发展速度日新月异,但化肥的大量使用严重影响了土壤结构，破坏了土壤的生态平衡，而固氮菌可以为作物提供氮素营养，并对促进生态系统中营养物质再循环，维持生物圈的正常功能起着重要作用。因此，固氮菌肥料在这一领域将会有广大的前景。 　　 试验对结缕草(Zoysia japonica)根际土壤中分离到的5株固氮菌菌株的最适温度、最适pH值以及最佳通气量等条件进行研究，在上述基础上测定各个菌株的典型生长曲线，这些数据对有效地利用和促进菌株生长具有重要现实意义，可为生物菌肥的研制及禾本科植物菌肥的使用提供必要的理论数据。 　　1 材料和方法 　　1.1 供试材料 　　 供试菌株为从海南大学校内结缕草草坪根际土壤中分离、纯化，并经形态学、生理生化特性鉴定及固氮酶活性测定筛选得到的高效固氮菌株，菌株标记为N1、N4、N5、N6、N8共5株，供试菌株的鉴定已在《草原与草坪》2011年第1期上发表，见参考文献［14］，其固氮酶活性为194.5 C2H4 nmol/(mL#8226;h) （N8）～215.4 C2H4 nmol/(mL#8226;h)（N1）。 　　 培养基为LB液体培养基[15]。 　　1.2 试验设计 　　 试验均以未接菌的LB液体培养基为空白对照。 　　1.2.1 温度条件对菌株生长的影响 按2%接种量分别将菌株接种到LB液体试管培养基中，每个菌种接种4管，分别于10、15、20、25、30、35、40、45 ℃振荡培养(180 r/min) 48 h，然后测定每个菌株的OD600 nm吸光值，并计算平均值，以确定各菌株的最适生长温度。以OD600 nm吸光值为纵坐标，温度为横坐标，生成坐标图。 　　1.2.2 初始pH对菌株生长的影响 将菌株按2%接种量分别接种到pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB液体试管培养基中，每个菌种接种4管，置于180 r/min 28 ℃的振荡培养箱中培养48 h，然后测定其OD600 nm的平均吸光值，确定每种菌株的最适生长pH值。以OD600 nm吸光值为纵坐标，pH为横坐标，生成坐标图。 　　1.2.3 通气条件对菌株生长的影响 将菌株按5%的接种量接种到装液量为30、50、100、150和180 mL的三角瓶（250 mL）中，28 ℃振荡培养(180 r/min)48 h后测定OD600 nm的平均吸光值。确定每种菌株的最佳需氧量。以OD600 nm吸光值为纵坐标，通气量梯度为横坐标，生成坐标图。 　　1.3 典型生长曲线的测定 　　 将各菌株分别从保存的试管斜面上取一环接种于10 mL液体LB培养基中，于28 ℃，150 r/min振荡培养12 h作为种子液。 　　 按2%的接种量将种子液接种于200 mL LB液体培养基中，振荡混匀，以每支10 mL分装于标记为0、2、4、6、8、10、12…24 h的13支试管中，于每个菌株的最适培养条件下培养。按标记时间从上述试管中各吸取l mL培养液，加入9 mL 灭菌生理盐水，混匀后取出1 mL加入下一支9 mL无菌的生理盐水中，依次类推，对菌液作10倍梯度稀释，稀释度为10-1、10-2、10- 3直到10-10，分别吸取各稀释度菌液0.1 mL涂布LB平板，3次重复，于每个菌株的最适温度培养48 h。计数菌液不同稀释度的3次重复的菌落数，菌落数在30～300 的为有效平板，求其平均值。计算出供试菌株各生长时间的菌数。 　　菌数(个/mL)=3个平板上菌落数的平均值×稀释倍数×10 　　2 结果与分析 　　2.1 温度对菌株生长的影响 　　 5株固氮菌株在10～45