血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的影响因素分析及改进.docVIP

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的影响因素分析及改进 　　摘 要 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验是高校生物化学实验必开实验项目之一，但实验影响因素较多。针对影响实验的各种可能因素进行分析并提出相应改进对策，以期为提高本实验的成功率提供一些可供借鉴的经验。 　　关键词 血清蛋白；醋酸纤维薄膜；实验仪器 　　中图分类号：Q5-33 G642.423 文献标识码：B 文章编号：1671-489X（2013）12-0132-03 　　血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物，利用血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等各种蛋白质的氨基酸组分、立体构象、相对分子质量和等电点不同，在电场中的移动速率不同，通过电泳分离的一种方法[1]。因为其具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点，成为生物化学实验课必开的实验项目之一。但在实际的操作中，影响实验的因素较多，除了电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象等因素外，实验课课前准备工作是否到位以及实验过程中学生的实验操作水平也直接影响实验结果的准确性和完整性。笔者结合多年实验教学经验和他人研究工作，对整个实验操作过程中需要注意和改进的地方进行阐明，期望为提高实验的成功率提供一些可供借鉴的经验。 　　1 实验课课前准备 　　1.1 实验材料 　　1）血清。本实验室一直以小牛血清代替人血清用于实验课程的教学，取得较好的实验效果。且有研究证实[2]，牛血清代替人血清进行醋酸纤维素薄膜电泳，其结果与人血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果相近，实验稳定，重复性好。小牛血清相较于宝贵的人血清，较易获得且储存稳定，组分纯净，没有其他杂质干扰，为实验结果的准确性提供了很好的保证，用于实验课教学完全可以达到预期的实验目的和要求。 　　实验用血清标样的质量问题是直接影响电泳结果的关键要素[3]。用不新鲜或溶血血清标样进行电泳，容易造成电泳图谱区带不清晰，更有甚者会出现拖尾现象。因此，血清应采用清澈透亮且无溶血现象的标样，且解冻后的血清必须置于冰箱4 ℃冷藏储存，每次实验前需仔细观察，如出现浑浊或溶血现象要及时更换，保证血清的新鲜。 　　2）醋酸纤维素薄膜。醋酸纤维素薄膜的质量对电泳的结果有很大的影响。薄膜厚薄质地均匀，无光泽面（糙面）微孔均匀，在电泳时跑出的区带均匀；相反，质地不均匀，无光泽面（糙面）微孔不均匀，在电泳时会造成区带不清晰，蛋白质在白色斑点处不泳动的现象，影响电泳图谱的完整性。因此，电泳时要选择厚薄质地比较均匀的薄膜进行电泳，其辨别方法是：用镊子取干薄膜轻放在电极缓冲液的表面，如薄膜迅速湿润，且整条色泽深浅一致，则表明此薄膜质地均匀；如薄膜表面出现深浅不一的条纹或斑点等，则表明此薄膜质地不均，应舍弃不用[4]。 　　1.2 实验仪器 　　1）电泳仪电源。应选择电压、电流等各项性能指标均稳定的电泳仪电源。笔者曾用即将淘汰的不稳定电泳仪电源进行电泳实验，所得到的电泳图谱区带分离不清，容易出现拖尾及跑偏等现象，严重影响实验结果的准确性。 　　2）电泳槽。电泳槽准备时，要首先检查槽中铂金丝连线是否正常连接正负极插口。若掉线，电泳时会造成蛋白质不泳动，无法跑出相应的区带。制作电泳槽上的滤纸桥要根据膜支架的长度和高度裁剪大小合适的滤纸，一般要采用双层滤纸桥。另外，将滤纸桥用缓冲液湿润后，要用玻璃棒轻轻朝一个方向挤压，赶掉里面的气泡，使滤纸紧贴在膜支架上。整个实验期间，盛有电极缓冲液的电泳槽应处于封闭状态，以防缓冲液的蒸发改变其pH值及离子强度，对实验结果造成影响。 　　3）点样器。实验教材[1]选用载玻片作为点样器，由于其长端截面较厚，且玻片宽度稍比薄膜宽，点样时容易使血清过多，横跨薄膜，最终导致电泳后电泳图谱蛋白质分离不均，有明显的边缘效应，且易产生拖尾现象。因此，实验室选用小巧的盖玻片作为点样工具，其端面佷薄，容易切割，点样时较易形成细条带，增加电泳的成功率。 　　1.3 实验试剂 　　1）电极缓冲液。应根据所测样品理化性质，从缩减电泳时间和提高图谱分辨率出发选择缓冲液的种类、离子强度和pH。血清蛋白纤维素薄膜电泳可选用pH8.6，离子强度在0.06～0.09之间的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液，这两种缓冲液共有的优点是具有强挥发性，对显色和紫外光等观察区带无影响。另外，用硼酸缓冲液作为电极缓冲液进行电泳，具有使电泳图谱更清晰完整、无毒副作用、费用低、使用时效长等优点[5-6]，其取代传统的巴比妥缓冲液必将成为一种趋势。 　　缓冲液配制时，为保证其离子强度和pH，应用电子分析天平精确（0.001 g）称量，定容后再用pH计校正。 　　2） 染色液。染色液选择的一般原则是染料对被分离样品有较强的着色力，水溶性好、稳定、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复