三株坦桑尼亚野生灵芝菌株人工栽培子实体活性成分含量剖析.docVIP

三株坦桑尼亚野生灵芝菌株人工栽培子实体活性成分含量剖析 　　灵芝(??Ganoderma??)在中国有悠久的药用历史，长期被人们用于气管炎、肝炎、高血压、肿瘤、免疫力紊乱等病症的辅助治疗。现代的药理和临床研究结果也表明灵芝含有抑制肿瘤和调节免疫的活性成分［1］。自DONK (1948)建立灵芝科(Ganodermataceae)以来，目前全世界已报道的灵芝科大型真菌共200余种［2］，分别隶属于灵芝属(??Ganoderma??)，假芝属(??Amauroderma??)，鸡冠孢芝属(??Haddowia??)和网孢芝属(??Humphreya??)［3］。我国有记载的灵芝有103种，其中14种已被人们所利用［2］。目前在国内应用广泛的品种包括赤芝（??Ganoderma lucidum??），紫芝(??Ganoderma sinense??)等，灵芝属的许多其它种类也具有类似的药用活性，值得进一步研究。?? 　　在执行2008年国家科技合作项目的过程中，笔者对非洲的坦桑尼亚东部及北部的野生食用菌资源进行初步调查和采集分离。坦桑尼亚位于非洲东部，东临印度洋，气候温暖湿润，常年气温在20~25 ℃之间，一年中分为雨季和旱季，森林资源丰富，非常适于大型真菌生长。其中坦桑尼亚北部的Amani野生保护区采集点位于南纬5°06，东经38°37，海拔高度860 m，是乔木林山地，遮荫明显，湿度很大，调查时温度约20 ℃。笔者在该自然保护区采集到3个灵芝属野生菌株（菌株粤GL-非132、粤GL-非85和粤GL-非119），本研究对3个菌株人工栽培子实体中活性成分进行测定，以期初步了解这些菌株的开发利用价值。 ?? 　　1 材料与方法 　　1.1供试菌株 　　菌株粤GL-非132、粤GL-非85、粤GL-非119为笔者于2008年采自非洲坦桑尼亚Amani野生保护区的野生菌株，人工栽培出菇后，经华南微生物资源中心李泰辉教授鉴定分别为赤芝（??G. lucidum??）、无柄紫灵芝(????G. mastoporum??)和无柄灵芝（??G. sessile??）；菌株粤GL-YW（赤芝??G. lucidum??）和粤GL-YWZ(紫芝??G. sinense??)为国内常用栽培种。5个参试菌株均由广东省微生物研究所食用菌研究发展中心保藏。?? 　　1.2培养基 　　母种培养基（综合PDA培养基）：20%马铃薯，2%葡萄糖，0.3%磷酸二氢钾，0.15%硫酸镁，微量维生素B????1，2%琼脂。?? 　　原种培养基：74%高粱，25%小米，1%轻质碳酸钙，含水量（50±2）%，pH自然。?? 　　栽培料：80%木屑，18%麸皮，2%碳酸钙，含水量63%，pH自然。?? 　　1.3试验方法 　　1.3.1原种制备 　　500 mL三角瓶装原种培养料50 g(折合干料)，121 ℃灭菌60 min，冷却后接入母种（接种块15 mm×18 mm/瓶），25 ℃培养箱中黑暗培养，待菌丝满瓶后作原种。?? 　　1.3.2接种、出菇管理 　　15 cm×30 cm聚丙烯袋装栽培料350~??400 g（折合干料），121 ℃灭菌90 min，冷却后接入灵芝原种（接种量2%），每个菌株48袋。栽培袋于??25 ℃、空气相对湿度60%~70%的培养室中避光培养，待菌丝长满袋后，继续培养10 d左右；打开栽培袋颈圈，栽培袋之间留1~2 cm空隙竖直排放，于27~30 ℃、相对湿度85%~90%，每天光照10 h（300~500 lux）条件下培养至子实体完全成熟采收。采收子实体40~60 ℃烘干。?? 　　1.3.3活性成分含量测定 　　1.3.3.1 粗多糖的提取与含量测定?? 　　称取0.25 g子实体粉(经300 g摇摆式粉碎机粉碎)，按料水比1∶40比例加入蒸馏水，沸水浴??2 h，2000 ??g?? 离心15 min，残渣加入等量蒸馏水沸水浴1 h，2000 ??g??离心15 min，沉淀物再用??5 mL蒸馏水洗涤，2000?? g??离心15 min，合并3个上清液，并用蒸馏水定容至25 mL。准确量取??1.0 mL加无水乙醇5 mL，振荡均匀后静置过夜，2000 ??g??离心??15 min，弃去上清液，再加无水乙醇5 mL，静置过夜后离心，沉淀物用去离子水溶解定容至10 mL为样品液，备用。葡萄糖标准曲线的制作和总糖含量测定参照文献［4］。试验3个重复。?? 　　多糖含量=0.9×总糖含量?? 　　1.3.3.2 总三萜物质的提取与含量测定?? 　　精确称取0.5 g子实体粉于10 mL比色管中，加入10 mL无水乙醇摇匀，超声波（45 kHz）处理1 h后，50 ℃水浴1 h，过滤后，提取液