核桃降压肽的制备与分离纯化-研究.pdf

万方数据 摘要 生物活性肽来源于天然，其安全性高，对人体有着非常重要的调节作用。制备具有降血压活性 的血管紧张素转换酶(angiotensin Ⅰ-convertingenzyme,ACE)抑制肽是生物活性肽研究的热门领域之 一。研究以核桃经过提油后的副产物核桃粕为对象，制 ACE抑制肽。优化了核桃粕的酶解工艺， 以ACE抑制率为指标，通过对比单酶酶解和双酶分步酶解两种方法得到的酶解液ACE抑制率的大 小，选出最优的酶解方法，并且优化其佳酶解条件。同时，在酶解的基础上，探讨了核桃降压肽的 初步分离纯化。 (1) 以脱脂核桃粕为原料，用碱溶酸沉法，提取其中的蛋白质。分别用碱性蛋白酶、中性蛋白 酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对核桃蛋白进行酶解，制备核桃多肽。以ACE抑制率和水解度为指标， 选出水解度和ACE抑制率较高的两种酶，并且分别对选出的两种酶的酶解条件：底物质量浓度、加 酶量、酶解温度、酶解时间和pH值进行单因素实验，在单因素实验的基础上对核桃降血压肽的最 佳水解工艺采用响应面法优化。结果表明：碱性蛋白酶和风味蛋白酶对核桃蛋白酶解得到的水解度 和ACE抑制率相对较高。碱性蛋白酶酶解核桃蛋白制备核桃降压肽，最优条件是：底物质量浓度 30g/L、加酶量8000U/g、酶解温度57℃和pH8.6的条件下水解3h，在这些条件下，所得到的ACE 抑制率为64.32％。风味蛋白酶酶解核桃蛋白制备核桃降压肽，最优条件是：底物质量浓度15g/L、 加酶量6000U/g、pH6.5，酶解温度50℃，酶解3h，在这些条件下，得到的ACE抑制率为57.92%。 (2) 选用水解度和ACE抑制率较高的两种酶将核桃蛋白进行分步水解制备降血压肽。以ACE 抑制率和水解度为指标，对酶解液的底物质量浓度，双酶复配配比以及加酶量进行单因素实验，然 后采用响应面法优化其制备核桃降压肽的最优酶解条件。结果表明：在底物质量浓度29g/L、加酶 量6000U/g、双酶复配配比3:2 的条件下，ACE抑制率可达67.05%。对比碱性蛋白酶单酶水解和碱 性蛋白酶与风味蛋白酶两种酶分步酶解核桃蛋白得到的ACE抑制率，采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶 双酶分步水解效果优于碱性蛋白酶单酶的水解效果。 (3) 对于核桃降压肽酶解液的初步分离纯化，本研究采用超滤法和凝胶层析法。首先，分别用1 kDa和3kDa 的超滤膜，将酶解液进行两次分离，得到三个分子量不同的组分：＜1kDa （A）、1-3 kDa （B）和＞3kDa （C），分别测定三个组分的ACE抑制率，分别是71.49、39.51、16.94，可以 看出，A组分的ACE抑制率明显高于B、C组分。然后，将超滤所得的组分A进一步采用凝胶层 析，得到三个峰，峰2 的ACE抑制率最高，达到了75.92%，峰1、峰3 的ACE抑制率分别是：44.78%、 58.49%。对凝胶层析分离出的峰2组分进行冷冻干燥，得到核桃ACE抑制肽粗品。 关键词：核桃粕,ACE抑制肽, 酶解, 响应面分析, 纯化 I 万方数据 Abstract Activity peptides,derived fromnature,were very important inregulating the humanbody.Inrecent years, the ACE (angiotensin Ⅰ-converting enzyme) inhibitory peptide is attracting more and more attentionsduringtoitsspecialbioactivity. In this study, walnutprotein, extracted form skimmedwalnut,was used to produce ACE inhibitory peptide. Thehydrolysis ofwalnutprotein was investigatedby comparingtwo kinds ofmethods by