Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用　.docVIP

Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用 ：焦敏南克俊雷燕张茜孙海凤 】目的：研究金雀异黄素（genistein）对人乳腺 癌细胞株MDA?MB?231体外侵袭能力的影响并探讨其机制. 方法：采用细胞体外侵袭实验系统，观察genistein对乳 腺癌细胞体外侵袭能力的影响；应用WesternBlot检测药 物作用后丽P?2,丽P?9蛋白表达的变化，采用明胶酶谱分 析法对药物作用前后乳腺癌细胞分泌的MMP?2，M M P?9活性 进行分析.结果：在药物作用2 4, 4 8，72h后，15umol/L 组和30 umo 1/L组侵袭至Matr ilge 1滤膜下的细胞数分别 为（245±12 ）个，（300±20）个，（378±18）个和（155 ±20）个，（204±30）个，（256±34）个，较空）.Wester nBl ot结果显示，在药物作用48h后，0，15, 30 u mo 1/L 组的M MP?2蛋白相对值分别为土，土和土；画P?9的相对 值分别为土，土和士明胶酶谱分析结果显示，15, 30 U mol /L组基质金属蛋白酶活论：geniste in有效抑制乳腺癌侵 袭和转移，其作用机制可能与降低乳腺癌细胞运动能力， 抑制丽P?2，丽P ?9表达水平与活性有关. 关键词】乳腺肿瘤；染料木黄酮；侵袭；基质金属 蛋白酶类 0引言 金雀异黄素（g en istein）是一种植物来源的异黄酮 化合物，是大豆中重要的非营养成份，对人乳腺癌细胞、 肝癌细胞等多种肿瘤细胞具有体外抗增殖作用［1］，但有 关geniste i n对乳腺癌侵袭转移作用的研究尚少见报道. 本研究以人乳腺癌MDA?MB?231细胞株为研宄对象，观 gen is tein对其侵袭转移的作用并探讨可能的分子机制 为gen istei n应用于肿瘤临床治疗提供实验依据. 1材料和方法 材料雌激素受体阴性乳腺癌细胞株MDA?MB?231 （美国模 式菌种收集中心ATCC细胞库）;genis te in,明胶（美国 Sig ma公司）；鼠抗人丽P?2，丽P?9mA b （北京中山生物 工程公司）；D MEM培养基（美国G ibco公司）；胎牛血清 （杭州四季青生物工程材料有限公司）；Q550IW图像分析仪 （德国LEICA公司）. 方法 体外细胞侵袭实验在24孔培养板中放入Transw ell小 室（装有聚碳酸酯微孔滤膜，孔径8 um）,将基质胶用无血 清DMEM培养液按1 : 20稀释后，取1⑻PL包被Tra n swell小室底部，无菌风干.下室内加入8 00 u LDMEM培养 液.将含有X 103个M D A?MB?231细胞的悬液接种于上室， 加入药物genite in使其终浓度分别为0，15，30umo 1/L 37 °C孵育 2 4，48，72 h 后，取出 Transw el 1 小室，/L， 淋洗，棉签擦拭微孔膜上层，将已经侵入并贴附于微孔膜 下层的细胞固定于20 g/L多聚甲酸中30 m in, Giemsa染色 后进行细胞计数. 检测乳腺癌细胞株MDA?MB?23 1传代于10 0mm的培养 皿中，待细胞贴壁后，分别加入浓度为0 , 15，30 y mo 1 /L的geniste in,作用48h后，分别提取细胞总蛋白分析. 细胞用冷PBS洗涤2次，用300 u LRa pa裂解液裂解细胞， 细胞裂解物_80°C过夜，然后刮取细胞，以12000 g, 4°C离 心15min ,收集上清移入新的离心管中，考马斯亮兰法定 量样本蛋白浓度.依据测定蛋白浓度，取20yg总蛋白进行 100g/LS DS?PAGE胶电泳，然后电转移至NC膜上.用含有 50g/L去脂奶粉的TBST（T BS+lg/L吐温_20）封闭；分别加 入一抗MMP ?2，酮P?9mAb （各按1 : 250稀释），孵育2h， TBST漂洗3 Omin； HRP?标记羊抗鼠IgG孵育1 h; TBST漂 洗30m in; ECL显色.同时以P ?actin蛋白为内参照.Weste rn Blot结果用B and scan扫描软件进行灰度测定. 癌细胞条件培养液的收集以2X10 5/孔的密度将细胞 种植于6孔培养板中，用含1 0 OmL/L胎牛血清的DMEM培养 基培养长至60%密度时，镜下观察见细胞贴壁良好，以无血 清DMEM洗3遍，每孔再加入DMEM（无血清，含有不同浓度 geni stein） ImL,继续孵育48 h，收集培养上清液并活细胞 计数，以300 0r/min,离心5 min去除细胞碎片，以细胞数 为依据调整体积，分装后立刻进行酶谱分析或冻存于_80°C 备用. 明胶酶谱活性分析将细胞条件培养液上样于100g/L SDS?聚丙烯酰胺凝胶（胶中含