猪传染性胃肠炎病毒全基因组扩增与S蛋白表达.pdfVIP

摘 要 猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenieritis ，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissible Gastroenteritis Virus of Swine ，TGEV) 引起一种高度接触性肠道传染 病，它的主要症状是呕吐、腹泻和脱水，对我国的养猪业造成了很大的危害。 本研究对实验室先前进行的流行病调查所检测到的疑似感染TGEV 阳性粪样进 行处理后，对 TGEV 敏感的 ST 细胞及 PK15 细胞进行攻毒，盲传 10 代后 ST 细胞 产生病变，收集第 10 代的细胞液。同时参照 GenBank 数据库中收录的 TGEV 的TS 株 S 基因B 、C 位点的序列设计一段特异性引物，对已产生病变的细胞液进行RT-PCR 检测，经过电泳检测后发现了预期大小的 TGEV S 基因 B 、C 位点的目的片段，测 序后与 GenBank 数据库中 S 基因 B 、C 位点序列核苷酸同源性达到 99.6%，证明了 成功分离并培养了 TGEV，命名为TGEV-AYU 株。 利用 GenBank 上已公布的 TGEV 全基因序列设计 17 对特异性引物，以大量扩 增的 TGEV 细胞液为模板，对 AYU 株进行 RT-PCR 扩增，对得到的 17 个 cDNA 片 段经过克隆后送到生物公司进行测序、拼接，获得一个 TGEV 基因组全长的 cDNA 序列，与 GenBank 中已收录的其余的TGEV 分离株序列进行比对后发现 AYU 株与 Purdue P115 株的序列同源性高达 99.5% 。TGEV-AYU 株序列全长为 28580bp ，含有 7 个开放阅读框，将其提交 GenBank 收录，收录号为 HM776941 。TGEV 全基因序 列测定后可以对下一步即将进行的 TGEV 的感染性克隆奠定良好的基础。 设计一段 TGEV S 基因 D 位点缺失序列的特异性引物，利用 RT-PCR 法扩增出 的基因片段，克隆到原核表达载体 pET-32a 上，经酶切、测序鉴定后，再将重组表 达质粒转化至大肠杆菌探查 BL21 中，用终浓度l mmol∙L-1 IPTG 诱导，表达产物以 包涵体形式存在。超声波裂解菌体后对包涵体进行溶解，再用 Ni-NTA 柱对重组蛋 白进行纯化，并对纯化的蛋白进行复性。S 蛋白的表达为下一步蛋白功能基因组研 究及 ELISA 检测方法的建立奠定了基础，另外可以为 TGEV 单克隆抗体的制备提供 蛋白。 关键词：猪传染性胃肠炎病毒；AYU 株；RT-PCR ；序列分析；原核表达 Cloning of Genome of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Expression of S Protein Abstract Transmissible gastroenteritis of swine(TGE) is a important enteric infectious diseases caused by transmissible gastroenteritis virus(TGEV).The clinical symptoms of TGEV is diarrhea and dehydration and vomiting. It becomes the most important disease threat the pig industry. The possible positive were homogenated and the supernatant was incubated on the ST and PK15 cell monolayer, the virus induced cytopathic effect (CPE) after ten generations passed on the cells. A pair of primers was designed based on GenBank of S gene B_C position. The expected DNA were amplifed by RT-PCR, the results showed that