超声微泡促进Matrilin-2+shRNA转染对肝卵圆细胞增殖影响的-研究.pdf

5． 于肝切除术后第4、8、12、16、20天处死D、E、F三组大鼠获取肝脏组织， 每个时间点处死5只大鼠。切取一部分立即快速冰冻切片，并于荧光显微镜下 观察EGFP表达；另一部分用10％中性甲醛固定，用于制作病理切片，观察各 组各时间点HOC形态及增殖情况，SP免疫组织化学技术检测卵圆细胞标志 OV-6表达；最后切取一部分组织保存于液氮，备实时定量PCR方法检测各组 各时间点肝脏组织中matrilin．2mRNA的表达。 6． 运用SPSSl8．0软件包对matrilin．2 线性相关分析。 【结果】 1．建立体外留置性门静脉置管模型的20只大鼠中，2只大鼠因术中操作致出血 死亡，术后15h出现1只大鼠死亡，解剖发现死亡原因为导管从血管中脱出导 致出血，其余17只大鼠全部存活，总存活率为85％。 2． EGFP在肝脏的表达情况：A、B、C三组大鼠转染后24h发现少量荧光于肝脏 表达，第3天达到高峰，A组3天后逐渐减少，至第7天荧光基本消失；B、 C两组转染后且第7天仍持续表达，此后减少，第11天仅见微量荧光表达： 转染后第3天及第7天B、C两组转染效果较A组均明显增强(p0．01)，转染 后第3天C组较B组转染效果略有增强(p0．05)。 3．肝卵圆细胞增殖模型大鼠一般情况：D组，即单纯卵圆细胞增殖模型组大鼠术 后活动减少、精神差，随后出现毛松无光泽、尿黄、腹水，3只大鼠死亡，死 亡率10％，鼠尾静脉(E)和门静脉(F)质粒注射干扰组被毛松乱更明显、尿黄， 腹水增多，死亡率分别为13．3％和20％。 4．肝卵圆细胞增殖模型大鼠形态学与组织学变化：D组大鼠肝脏代偿性增大、充 血、肝缘圆钝，表面及切面可见散在圆形点状病灶、不凸出肝表面，部分见出 血点。镜下肝细胞水肿、肝索结构紊乱，汇管区增生反应，可见圆形或卵圆形、 胞浆少、核质比高的HOC，术后20天结构完全恢复，恢复后肝索排列整齐。 E、F两组和D组相比，肝脏出血点明显，点状病灶增多，镜下肝细胞水肿严 重，肝索结构紊乱，汇管区增生反应较模型组少，术后20天恢复后肝索结构 较D组紊乱。 2 5． 免疫组织化学检测OV-6表达：D组术后4天于汇管区可见OV-6表达阳性的 细胞，第8天阳性细胞数明显增多，第12天阳性细胞数达到高峰，开始离开 汇管区想小叶中央迁移，部分OV-6阳性细胞己开始分化，第16天OV-6阳性 细胞数明显减少，第20天仅见极少数OV6阳性细胞。E、F两干扰组与D组 相比，第8天及第12天OV-6阳性细胞数减少(pO．05)，两干扰组之间无明显 差异。 6． mIⅢA表达达到高 实时定量PCR检测matrilin．2表达：D组第12天matI．ili_n．2 峰，此后减少，第20天基本恢复正常生理水平。E、F两干扰组第8天、第 12天表达较D组少(p0．05)，第20天较正常生理水平略高。 7． 将HOC计数与matrilin．2mRNA表达量行线性相关分析：D组相关系数r= 相关性有统计学意义(P0．05)。 ’ 【结论】 1． 成功对大鼠体外留置性门静脉置管模型改良，具有操作方法简单、术后死亡率 低、成功率高等优点。 2． 超声联合微泡造影剂促进目的基因的体内转染率，尤其联合门静脉置管模型增 强效果更明显，有望成为一种有效、安全的肝脏靶向性基因转运方法。 ，一 3． 成功建立大鼠HOC增殖模型，且matrilin．2mIⅢA表达与HOC增殖数目呈正 相关关系。 4． 超声微泡介导转染matrilin．2shRNA质粒有效下调了大鼠ma吲in．2表达， 参与调控HOC增殖介导的肝再生。 5． 阐明肝内ECM成分在维持肝脏正常结构和细胞增殖、分化、迁移方面具有重 要作用。 【关键词】 肝卵圆细胞，母系蛋白．2，细胞外基质，超声微泡，IⅢA干扰 3 ontheEffectofMatriIin一2shRN