川中黑山羊RBP4基因cDNA克隆及序列剖析.docVIP

川中黑山羊RBP4基因cDNA克隆及序列剖析 　　摘要：以川中黑山羊肝脏组织总RNA为模板，通过RT-PCR技术对黑山羊RBP4基因进行克隆测序及序列分析。结果表明，所克隆的665 bp片段为预期的川中黑山羊RBP4基因cDNA序列，包含整个CDS区，该编码区长为606 bp，编码201个氨基酸。用DNAMAN软件进行同源性比对，结果显示，川中黑山羊RBP4基因编码区与GenBank中报道的牛、猪、马、黑猩猩、小鼠、大鼠、人的同源性分别是98.5%、91.3%、92.2%、91.4%、83.0%、82.3%、91.3%；氨基酸序列同源性分别为97.5%、91.5%、93.5%、91.5%、83.6%、83.6%、91.5%。利用NJ法和MP法以该基因编码区核苷酸序列构建物种间分子进化树，其结果基本一致。聚类结果与遗传距离大小一致，表明RBP4基因编码区适用于构建物种间分子系统进化树。 　　关键词：川中黑山羊；RBP4基因；分子克隆；序列分析 　　中图分类号：S826；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0697-04 　　视黄醇结合蛋白（Retinol-binding proteins，RBPs）是存在于动物体内以实现维生素A从肝细胞内转运至靶组织，并参与血清和细胞内视黄酸、视黄醇转运代谢的一种特异性运载蛋白，类属于疏水小分子结合蛋白家族[1]。RBPs在协助维生素A发挥生理功能中起着不可替代的作用。首先，RBP与维生素A结合后再与甲状腺素运载蛋白结合，形成VA-RBP-TTR复合体，伴随血液循环流经靶组织，与RBP的可识别受体结合，然后将维生素A转运到细胞内的受体上，以此完成其运载功能[2]。RBP主要在肝脏细胞中合成，合成后释放到血液中，最后通过内循环进入动物体内各组织。但RBP基因的mRNA在哺乳动物的卵巢、输卵管、卵泡、黄体、子宫内膜、肝脏、小肠、睾丸和附睾等多种组织中都有表达，只是在不同物种、组织器官和不同发育时期存在表达差异[3]。研究显示，视黄醇结合蛋白4基因（RBP4）在猪妊娠关键期的转运作用和胚胎发育过程中发挥重要作用，从而影响猪的产仔数[3，4]，RBP4是产生孕体的主要蛋白质之一。 　　目前，有关RBP基因在人、猪、牛、绵羊、小鼠、大鼠等物种中的研究均有报道，但在山羊物种中的研究尚未见报道。繁殖性状是山羊最为重要的经济性状，提高山羊产活羔率是增加山羊经济价值的重要手段，提高山羊繁殖力则普遍成为世界养羊业所追求的目标。而川中黑山羊是经过长期自然选择和人工重点选育的多胎山羊品种，具有性成熟早（母羊初情期为3～4月龄，初配年龄为5～6月龄）、产仔率高（平均产羔率为270%）、生长速度快、产肉性能好、耐粗食、抗病力强、适应性良好等优点[4，5]。 　　本研究以川中黑山羊为研究对象，首次对山羊的RBP4基因CDS区进行克隆测序及序列分析，与GenBank中其他物种的相应基因进行序列比对，并在此基础上构建物种间分子系统进化树，以期为进一步开展川中黑山羊RBP4基因的定位、表达调控以及繁殖性状的相关分析等提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 样品采集 　　从四川省乐至县天龙科技示范园选取6只3～5岁健康的黑山羊，屠宰后采集肝脏组织，迅速放置在室温生理盐水中，并冲洗3次，放于RNA later 中，然后放置到盛有液氮的液氮罐中保存，带回实验室保存于超低温冰箱（-70 ℃）中，用于RNA提取。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　动物组织总RNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、感受态细胞均购自天根生化科技（北京）有限公司，反转录试剂盒购自FERMENTAS（MBI）公司，X-Gal、IPTG、氨苄青霉素（Ampr）、克隆载体PMD-19 Vector购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。 　　1.3 总RNA的提取 　　依据动物组织总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取川中黑山羊肝脏总RNA。依据反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。 　　1.4 引物设计及目的基因PCR扩增 　　参考GenBank已公布的牛视黄醇结合蛋白（RBP4）基因（登录号：NM_001040475）的mRNA序列，应用 Primer Premier 5 设计1对引物，预期扩增片段长度为 665 bp，引物序列送上海英俊生物有限公司合成（表1）。以合成的川中黑山羊肝脏cDNA为模板，构建25 μL PCR扩增体系。上、下游引物各1 μL，cDNA模板0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix酶12.5 μL，水10 μL。PCR 扩增程序为：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性40 s，60 ℃ 退