圆二色光谱仪原理应用.DOCVIP

圆二色性光谱及其应用 （Circular Dichroism，CD） 光学活性分子对左、右圆偏光的吸收率的差值 1、自然光 光具有波、粒二象性，是横电磁波。只有横波才有偏振现象: 光矢量的振动方向与光的传播方向垂直， 在垂直于光传播方向的平面内, 有不同的振动方向。 电场矢量E和磁场矢量H互相垂直、位相相同。 由于感光作用都是E 引起的，因而，将E 作为光矢量。 振动面：E 与光传播方向组成的平面。 从统计规律上说，自然光的光振动: 在垂直于光速的平面上遍布所有方向， 沿各方向振动的光矢量呈对称分布, 相应光矢量的振幅（光强度）相等。 超高压短弧氙灯: 在高压纯净氙气中放电发光。 高亮度的点光源；?（2）日光色。色温接近6000K；（3）在可见光区连续光谱；（4）高显色性，显色指数＞95；（5）在整个寿命期内维持光色特性；（6）高电弧稳定性；（7）热重启能力；（8）启动后即能达到接近最大光输出；（9）电弧光斑小、易聚光。 2、光的偏振 双折射现象： 一束光射入各向异性晶体后有两束折射光。 尼科耳棱镜。 在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。 名称 折射定律 折射率 传播方向 寻常光 （o光） 遵守 对于晶体一切方向都具有相同的折射率 在入射面内 非常光 （e光） 不遵守 折射率随方向而变化 不一定在入射面内 o光和e光：频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光 光的吸收和圆二色性（circular dichroism, CD） 化合物在正常情况下，处于低能的基态，电子占据所有的成键轨道（σ、π、n轨道）。如果电子吸收了外界的能量，它就从基态跃迁到激发态能级。 如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄而不连续的谱线。 由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转动能级的跃迁，所以，紫外分光光度计测定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波长宽度并相对平滑的曲线。 应用 氨基酸的圆二色性 可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。 紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。 氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。 肽的圆二色谱 活性肽构象与其生理功能的关系 肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。 肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。 Far-UV (250-170nm) Secondary Structure: α-helix, β-sheet, β-turn, random Tertiary Structure Class: all-α, α+β, α/β, all-βI, all-βII Near-UV (320-250nm)： aromatic side chain Near-UV ~ Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins 芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区表现出CD信号 苯丙氨酸（ phenylalanine， Phe）：255、261和268nm附近； 酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右； 色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和291nm附近； 二硫键的变化反映在整个近紫外区。 Far UV CD spectra of poly-L-Lys Main CD features of protein 2ndary structures - band (nm) + band (nm) α-helix 222 208 192 β-sheet 216 195 β-turn 220-230 (weak) 180-190 (strong) 205 polypro II helix 190 210-230 weak Random coil 200 212 3、估算蛋白质二级结构含量 仅适合a含量较高的蛋白质！ 未知结构的蛋白的CD信号 将测得的CD曲线与标准曲线拟合。 xa+ xb + xc = 1.0 qt = xaqa + xbqb + xcqc 改变xa、xb和xc，使qt与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，least squares minimization ） CD signal of a protein depends on its 2ndary structure 磁圆二色谱（ Magnetic Circular Di