-第八章-蛋白质和氨基酸的测定-（p114）第一节-.ppt

蛋白质或多肽在羧肽酶作用下，被逐步降解及释放的氨基酸种类和数目随时间而发生变化，将经过一定间隔时间反应的样品分别取出，进行酸化失活处理后可用自动分析仪或HPLC仪进行快速测定，根据不同时间取样的分析结果便能初步确定C-末端基为何种氨基酸。若以酶作用时间为横坐标，对所释放的各氨基酸量（mol/L）为纵坐标作图，然后根据氨基酸释放的动力学曲线即可进一步判断和确定肽链C端的氨基酸顺序。 肽链C端的氨基酸顺序测定的关键在于测出第一个释放的为何种氨基酸，一般最好采用两种以上C－末端测定方法进行比较和验证才可靠。 * bjhk （二）试剂： 羧肽酶Y；牛胰核糖核酸酶A；降解缓冲液。 （三）操作步骤： 1、酶液和样品溶液的制备： 2、样品酶解： 3、氨基酸分析： 取上清液用自动氨基酸分析仪进行氨基酸定性或定量分析。 * bjhk （四）实验结果： 1、动力曲线绘制： 依据自动氨基酸分析仪测定所提供的数据，以酶解时间为横坐标，对不同时间所释放的各种氨基酸相应的量（mol/L）为纵坐标作图，绘制出氨基酸释放的动力学曲线图。 2、C－末端分析结果： 根据上述氨基酸释放的动力学曲线分析，判断和确定被测定蛋白质的C-末端为何种氨基酸，并写出其C－末端氨基酸排列顺序。 * bjhk 第五节 氨基酸的定性测定 一、氨基酸的一般显色反应 （一）茚三酮法： 常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用5g/L茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氮，以免背泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。 * bjhk （二）吲哚醌法： 1、原理： 各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辨认氨基酸。氨对吲哚鲲显色没有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。 2、试剂： 显色剂；底色退色剂。 3、显色步骤： * bjhk （三）邻苯二甲醛法： 邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。 1、原理： 邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最合适的激发光和发射光波长分别为340nm和455nm。 2、试剂： 邻苯二甲醛显色液，巯基乙醇，三乙胺，丙酮，石油醚等。 3、显色步骤： 将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中1min，冷风吹干，在温度18℃以下，湿度50％－90％之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。 4、说明： 显色时必须有一定的湿度，以便氨基酸溶解。 * bjhk 二、个别氨基酸的显色反应 （一）精氨酸的显色－坂口（Sakaguchi）反应： 1、第一种方法： 试剂①：5g尿素溶解于100ml，0.1g/Lα－萘酚乙醇中，使用前，每100ml加约5gKOH； 试剂②：0.7ml溴水溶解于100ml，5％NaOH中。 显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂①后，在空气中吹几分钟，再喷试剂精氨酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。 2、第二种方法： 试剂①：1g/L8-羟基喹啉的丙酮溶液； 试剂②：0.02ml溴水溶解于100ml，5％NaOH中。 显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂①，吹干后，再喷试剂②。精氨酸或其他胍类物质显橘红色。 * bjhk （二）胱氨酸和半胱氨酸的显色： 试剂①：1.5g亚硝基铁氰化钠溶于5ml，2mol/L硫酸溶液中，家95ml甲醇。使用时在每100ml上述溶液中加10ml28％氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持1d。 试剂②：2g氰化钠溶于5ml水中，然后加95ml甲醇。 显色步骤：半胱氨酸显色：在滤纸上喷试剂①的清液，5min后半胱氨酸显红色。 胱氨酸显色：先将滤纸浸入试剂②，迅速取出，稍等片刻再喷试剂①的清液，5min后胱氨酸显红色。 * bjhk （三）甘氨酸的显色： 试剂：0.1g邻苯二甲醛溶于100ml77％乙醇中。 显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力棕色