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穿心莲染色体制片优化及核型剖析 　　摘要：采用常规压片法进行穿心莲染色体制片方法及其染色体数量和核型分析的研究。结果表明，08：00―8：30取材较佳，以0.10%秋水仙素溶液作为预处理液，预处理2 h，在1.0 mol/L盐酸溶液中于60 ℃恒温解离8 min，低渗 15 min 后，卡宝品红溶液染色25 min压片镜检，所得穿心莲染色体制片效果良好。穿心莲体细胞染色体数量为2n=2x=48。首次报道了穿心莲核型公式为2n=2x=48=14m+22sm+12st，其中中部染色体（m）为7对，近中部着色点染色体（sm）为11对，近端部着色点染色体（st）为6对，核型不对称系数为67.61%，核型属3B型。 　　关键词：穿心莲；染色体；制片技术；核型分析 　　中图分类号： S567.21+9.02文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0033-04 　　穿心莲[Andrographis paniculata （Burm.F.） Nees]属爵床科穿心莲属一年生草本植物，具有抗病毒、抗肿瘤等作用，在国内外有广阔的市场和开发前景。我国穿心莲最早在广东省和福建省南部引种栽培，目前主产地为广东、广西、海南、福建等省（区）[1]。穿心莲主要以田间栽培为主，我国野生资源较少，而在穿心莲长期人工栽培生产中存在品种退化、产量和质量下降等问题，亟须进行新品种选育研究[2-3]。 　　目前，国内外对穿心莲的研究主要为种质资源调查与质量评价[2-3]、组织培养与栽培[4-5]、药用成分分析[6]、分子标记技术[7]等，对穿心莲细胞遗传学方面的研究较少。本研究进行染色体制片方法优化及核型分析，旨在为穿心莲遗传资源保护、优良种质选育和利用提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　供试穿心莲[Andrographis paniculata （Burm.F.） Nees]种子由广东省清远市穿心莲中?材生产质量管理规范（GAP）基地提供，染色体凭证玻片存放于广东药科大学中药资源系植物细胞与组织培养实验室。 　　1.2方法 　　1.2.1种子萌发试验参照李玲梅等的方法[8]，择颗粒饱满的穿心莲种子，用清水冲洗后用0.1% KMnO4溶液浸泡 30 min 取出，用无菌水冲洗，置于铺好的装有灭菌滤纸的培养皿中，在 25 ℃ 恒温培养箱中进行暗培养，胚根长至0.5～0.8 cm时切取根尖。 　　1.2.2不同取材时间的有丝分裂中期分裂相数比较于07：30―11：00每隔30 min取穿心莲胚根根尖，以0.05%秋水仙素处理3 h，并对不同视野下单位面积内的中期分裂相进行计数，以确定穿心莲胚根根尖的中期分裂高峰期和适宜的取材时间。 　　1.2.3预处理与固定取穿心莲胚根根尖区域，置于4种预处理液中进行不同时间预处理：（1）0.05%秋水仙素溶液；（2）0.10%秋水仙素溶液；（3）0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液；（4）0.10%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羟基喹啉混合溶液（体积比1 ∶1）分别在避光条件下处理1、2、3 h。取出经预处理的根尖，用蒸馏水冲洗2～3次，然后转入卡诺固定液（无水乙醇 ∶冰醋酸体积比=3 ∶1）中固定24 h。 　　1.2.4解离取固定后的根尖，于60 ℃恒温水浴中用 1.0 mol/L HCl解离5、8、9、10、11、15 min，取出经解离的根尖，冲洗2～3次后转移至蒸馏水中，室温下低渗处理15 min，然后经85%乙醇处理2～3 min，4 ℃保存备用。 　　1.2.5染色与压片取出根尖，只保留分生区，置于清洁的载玻片上，滴加2滴20%卡宝品红溶液，染色25 min，吸去染液，滴加稀甘油，采用常规压片法制片。 　　1.2.6染色体核型分析常规法压片后，选取分散较好的染色体装片于ZEISS Axioplan 2显微镜，在AxioVision 4.6图像分析系统下镜检与拍照，采用MetaSystems Ikaros软件系统进行染色体长臂和短臂测量，并进行染色体配对和核型分析。 　　筛选出最佳染色体制片方法，从最优的染色体制片中选取50个以上可准确计数的根尖有丝分裂中期相细胞，其中85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数，即可认为是穿心莲的染色体数[9-10]。核型取5个典型中期细胞的平均值，参照Kuo等提出的方法[11]计算染色体相对长度指数（I.R.L）；根据Levan等提出的方法[12]进行染色体类型分析；参照Stebbins提出的方法[13]进行染色体核型分析和相关参数计算；核型不对称系数（As.K）按Arano提出的方法[14]计算。 　　2结果与分析 　　2.1不同取材时间对穿心莲根尖细胞中期分裂相的影响 　　表1结果显示，穿心莲有丝分裂中