生物化学 蛋白质2(精品·公开课件).ppt

氧分子与血红蛋白的结合具有正协同效应 紧张态（T态）：铁原子偏离卟啉平面约0.06nm,偏向F8 His侧， ?1?21与?2?2呈双重对称排布， 对氧的亲和力低。 松弛态（R态）：铁原子被氧分子拉入卟啉环中， 牵动作用Hb亚基三维结构发生改变， 亚基间盐键断裂，亚基间结合疏松， ?1?21与?2?2 之间移位15°， 对氧的亲和力高。 蛋白质的沉淀、变性、凝固 稳定蛋白质亲水胶体性质的两个因素： 水化膜 颗粒表面电荷 Denaturation( 变性) 定义: 蛋白质的特定空间构象被破坏,从而导致其理化性质改变和生物活性丧失,称蛋白质变性. 蛋白质的理化性质与常用的纯化方法 理化性质 相应的分离纯化方法 分子大小和形态 差速离心、超滤、分子筛、透析 溶解度 盐析、萃取、分配层析、结晶 电荷差异 电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析 生物功能专一性 亲和层析 低盐浓度 洗脱液 高盐浓度 洗脱液 各试管进行连续收集 混合蛋白质 离子交换层析柱 + + + + + + + + + + + + + + + + 离子交换层析分离蛋白质示意图 试管走行方向 离子交换层析(ion exchange chromatography)： 凝胶过滤（gel filtration）： 凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的 微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部 后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的 路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒 内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短， 移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分 分开的目的 （二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法 离心(centrifugation)： 利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密 度的物质进行分离 根据转速分类：常用离心机 10 000 rpm 高速离心机 20 000~25 000 rpm 超速离心机 50 000 rpm 相对离心力（×g）= 1.119 × 10–5 × （rpm）2 × r 根据应用分类：分析型离心机 制备型离心机 [g: gravity, rpm: revolution per minut, r: 离心半径] 几种蛋白质的分子量与沉降系数的关系 在单位力场下，溶质分子的沉降速度与离心角速度、离心半径呈正比，其比例常数为沉降系数，用S表示，单位为秒。 = s· ?2 ? 一般蛋白质的沉降系数为10?13?10?12秒，故人们以Svedberg(S)单位来表示沉降 系数，即1S = 10?13秒。沉降系数的大小与蛋白质的密度和形状相关。 （二）多肽链的氨基酸序列分析 测序前的准备 N端分析以确定蛋白质的多肽链数目 断裂二硫键 分离单一多肽链 测定多肽链的氨基酸组成 多肽链氨基末端与羧基末端分析 二硝基氟苯（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene）法 丹酰氯 (dansyl chloride)法 多肽链的氨基酸序列测定和重叠组合 对多肽链进行限制性水解成小片段 Edman降解法进行小片段肽段的序列分析 对各片段序列进行比较叠加，拼出完整的多肽序列 相对荧光值 0 4 8 12 谷 天冬 羧甲半胱 天胺 丝 谷胺 组 甘 苏 精 丙 氨基丁酸 酪 蛋 缬 苯丙 异亮 亮 赖 氨基酸的