磁珠浓缩低浓度HBsAg方法的建立及应用免疫学专业论文.docx

广州医学院硕士学位论文 广州医学院硕士学位论文 磁珠浓缩低浓度 磁珠浓缩低浓度 HBsAg 方法的建立及应用 PAGE PAGE 10 PAGE PAGE 13 主要仪器设备 仪器名称 厂家 磁分离架 无锡中德伯尔生物技术有限公司 台式高速冷冻离心机Centrifuge 5804R 德国 Eppendorf 公司 LXJ-Ⅱ离心沉淀机 上海市医用分型仪器厂 台式高速离心机 美国Sigma公司 酶标仪Infinite M200 瑞士TECAN 全自动化学发光免疫分析仪I2000 雅培公司 荧光定量PCR仪LightCycler480 罗氏Roche公司 电泳仪、电泳槽 美国BIO-RAD DK-80型电热恒温水槽 上海医用恒温设备厂 78HW-1恒温加热磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司 T-00型电子天平称 美国双杰兄弟有限公司 微量移液器 美国Enpendoff公司 pH计 德国Beckman公司 超纯水系统 MiLLIPORE-Q公司 MSI微震荡仪 马来西亚KIKA公司 冻干机 美国LABCONCO 磁珠浓缩低浓度HBsAg方法的建立及应用 专 业：免疫学 研究生：林梅双 导 师：吴晓蔓 教授 中文摘要 背景 乙型肝炎病毒（Hepqtitis B virus, HBV）感染是一种严重危害人类健康的疾病。 乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）是乙型肝炎诊断及治疗评估 中非常重要的血清学标志物。在HBV感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性 感染末期的携带者等情况下，人体内会出现低浓度的HBsAg[1]。HBsAg浓度低的患者 可能存在着肝脏的持续性损伤和病毒复制[2]，如果漏检，可能影响患者的及时治疗， 或者导致HBV通过手术、输血等途径传播。对低浓度血清HBsAg进行有效检测，具有 重要的临床和流行病学意义[3]。 目前 检测 低 浓 度 HBsAg 灵 敏 度 较 高 的 方 法 是 化 学 发 光 免 疫 分 析 法 （chemiluminescence immunoassay，CLIA），但由于需要大型仪器，基层医院很难普 及，检测费用也比较高，大多数患者难以承受，有一定的局限性。酶联免疫吸附试验 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ，ELISA）检测HBsAg具有简单、方便、快速 的优点，但灵敏度不高，在HBsAg浓度比较低的情况下，经常会出现弱阳性或假阴性 结果。如何比较有效和经济的提高ELISA检测HBsAg的灵敏度是当前研究的重点。 本课题建立基于磁珠为介质的浓缩方法（磁珠浓缩法），分析磁珠浓缩方法的特 点，用于提高ELISA检测低浓度HBsAg的灵敏度与阳性检出率。结果将阐明磁珠吸附 蛋白质的机理，使磁珠提取蛋白在更多的蛋白质上进行推广发挥作用；寻找合理的吸 附纯HBsAg与血清HBsAg的实验条件，为磁珠在吸附与分离临床上其它蛋白质的运用 提供借鉴；阐明磁珠浓缩 HBsAg的作用，为临床提高ELISA检测低浓度HBsAg灵敏 度提供有效的浓缩方法，使磁珠浓缩方法在临床上推广。 目的 1. 通过研究羧基磁珠吸附纯HBsAg和血清中HBsAg的性能，确定磁珠浓缩血清 HBsAg的方法。与其它蛋白浓缩方法（高速离心、聚乙二醇透析、聚丙烯凝胶颗粒吸 附、真空抽干）比较，分析磁珠浓缩法的特点。 2. 确定磁珠浓缩法所能达到的最低检出限，探讨磁珠浓缩法在提高检测低浓度 HBsAg灵敏度与阳性检出率中的意义。磁珠浓缩HBeAg与HBVDNA阳性的血清标本， 探讨磁珠浓缩方法在乙型肝炎其它检测项目中的应用价值。 方法 1. BCA蛋白检测法检测磁珠吸附血源性HBsAg纯品前后的蛋白量，改变磁珠用量、 吸附时间、吸附温度等条件，探讨磁珠吸附HBsAg的性能；ELISA试剂盒检测磁珠吸 附血清HBsAg前后的吸光度值，改变磁珠用量、血清pH值、吸附温度、吸附时间、 PBS的pH值、洗脱液的种类与浓度等条件，建立最佳的磁珠浓缩血清HBsAg的实验条 件。 2. 分别使用磁珠浓缩法、高速离心、聚乙二醇透析、聚丙烯凝胶颗粒吸附、真空抽 干浓缩处理血清标本，比较浓缩前后ELISA检测的HBsAg的结果，并比较五种浓缩方 法的差异，分析磁珠浓缩法的优越性与可行性。 3. 标定HBsAg阳性临床血清，判断磁珠浓缩后ELISA检测HBsAg的最低检出限；磁 珠浓缩HBsAg阴性、不同稀释液稀释HBsAg阳性血清、低浓度HBsAg血清后，判断磁 珠是否会出现假阳性、是否受到其它微生物影响、是否能提高低浓度HBsAg的阳性检 出率。 4. SDS法电泳磁珠浓缩乙肝大三阳血清后的洗脱液，判断磁珠吸附蛋白的特 异性；ELISA法和实时荧光定量