基于荧光检测技术的多花黑麦草EST-SSR指纹图谱的构建.PDF

中国农业科学 2017,50(3):437-450 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.03.003 基于荧光检测技术的多花黑麦草EST-SSR指纹图谱的构建 1 1 1 2 2 1 1 刘欢 ，张新全 ，马啸 ，张瑞珍 ，何光武 ，潘玲 ，金梦雅 1 2 （四川农业大学草业科学系，成都 611130 ； 四川省草原工作总站，成都 610041 ） 摘要：【目的】构建基于 EST-SSR 荧光标记的多花黑麦草（ Lolium multiflorum Lam.）DNA 指纹鉴定体系， 为多花黑麦草品种鉴定提供高通量技术手段，为不同品种的合理应用提供参考依据，有效保护农民利益和育种权 益。【方法】利用表型性状差异大的3个品种（特高Tetragold、长江2 号ChangjiangNo.2和阿伯德Aubade），通 过聚丙烯酰胺凝胶电泳从200对EST-SSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好、扩增稳定的30对引物。在筛选 出的每对引物5′端添加荧光标记FAM后，采用毛细管法通过DNA分析仪检测 200个单株不同等位变异的扩增片段， 从 30 对 EST-SSR 引物中筛选出 25 对扩增稳定的荧光引物，建立基于高通量荧光 SSR 标记的多花黑麦草品种鉴定 体系。【结果】通过25对EST-SSR引物构建的DNA指纹图谱来进行10个多花黑麦草材料的品种鉴定。25对EST-SSR 引物共检测到127个等位基因，等位变异扩增片段长度范围为51—249 bp，每对引物可检测到有效等位基因数为 2—11 个，特异等位基因最多可检测到 11 个（N101），平均每对引物 4.00 个；多态性位点的比率范围为 33.33% —100.00%。平均 PIC 值为0.702，Shannon指数最大为3.322（N101），平均为1.929，基因多样性指数变幅为0.159 —0.500，平均 0.318，可鉴别的材料数为 0—10 个；其中 14 对特征引物在 10 个品种（系）上可检测出 25 个特 异等位基因。综合来看，引物N101在200 对引物中鉴别效率最高，可直接将10个多花黑麦草品种（系）区分开， 在长江2号、赣选1号和川农 2号上同时检测出特异等位基因。但由于多花黑麦草在品种间与品种内变异均较高， 因此为鉴定更多材料，从 25 对引物中选择了 6 对扩增和检测效果较好的引物（N54、N101、N146、N151、N154、 N156），6对引物可检测到的稳定等位基因数均不小于19 个，在达伯瑞和邦德上最多可检测到22个等位基因。通 过6对高效引物构建了10个多花黑麦草品种（系）的DNA 指纹图谱，包括标准模式图、图谱代码和图谱QR编码。 首次利用EST-SSR荧光标记毛细管电泳检测，为10个多花黑麦草材料分别构建了唯一的指纹代码和QR 编码。【结 论】利用 6 对高效引物构建了多花黑麦草 SSR 高通量鉴定体系，其中荧光引物 N101 多态性最高，可直接鉴别 10 个多花黑麦草品种（系）。 关键词：多花黑麦草；EST-SSR分子标记；指纹图谱；荧光检测；毛细管电泳 Construction of EST-SSR Fingerprinting Based on Fluorescence Detection Technology for Italian Ryegrass 1 1 1 2 2 1 1