副溶血弧菌刺激下拟穴青蟹免疫应答及一氧化氮合成酶基因的鉴定-生物化学与分子生物学专业论文.docx

汕头大学 汕头大学 2012 硕士论文 汕头大学硕士学位论文 副溶血弧菌刺激下拟穴青蟹免疫应答及一氧化氮合成酶 基因的鉴定 The immune responses to Vibrio parahaemolyticus stimulation and characterization of nitric oxide synthase gene in mud crab Scylla paramamosain 学 位 申 请 人：张昭 导 师：李升康 （副教授） 专 业：生物化学与分子生物学 答辩委员会主席： 答辩委员会委员： 汕头大学理学院 中国，汕头，515063 I I 中文摘要 拟穴青蟹是我国南部沿海的主要经济蟹养殖品种，具有很高经济价值。然而，近年来 青蟹养殖疾病的频频爆发，造成了巨大的经济损失，严重阻碍了养殖业的发展。前期研究 表明，副溶血弧菌是汕头牛田洋青蟹养殖病害的主要致病菌之一。本研究以牛田洋青蟹为 对象，研究副溶血型弧菌胁迫条件下拟穴青蟹相关免疫因子应答研究及免疫相关基因 NOS 的鉴定，为青蟹疾病防治及健康养殖奠定基础。研究结果如下： 1. 副溶血弧菌胁迫下拟穴青蟹多种相关免疫因子活力检测 实验条件下副溶血弧菌感染青蟹，测定不同时间拟穴青蟹的免疫相关因子的变化。结 果显示：试验过程中拟穴青蟹血细胞总数 HTC 随时间延长一直呈现下降趋势。总血细胞 酚氧化酶 PO 活力 18h 显著高于对照组，其他时间点无显著变化。血清酚氧化酶 PO 活力 在 114h 达到最大。血清超氧化物歧化酶 SOD 活力在 6h 到达最高值。 血清酸性磷酸酶 ACP 活力和碱性磷酸酶 ALP 活力在 42h 开始上升至 114h 达到最高。血清 POD 活力在 18h 开始上升至 114h 达到最高值。感染副溶血弧菌后，拟穴青蟹血细胞 NOS 酶活力升高，18h 后没显著差异，114h 降到最低；血清 NOS 酶活力一直处于较高水平。荧光实时定量 PCR 结果显示：proPO 基因转录水平应激上升，90h 达到最高；Cu/Zn-SOD 转录水平在 6h、42h、 90h、114h 处较高；CAT 转录水平一直处于较低水平，其中 42h 最低；td-SOD 转录水平 只在 6h 显著高于对照组；LYS 基因转录水平一直高于对照组，其中 18h 最高；CRU 基因 转录水平 114h 达到最高；ALFP 基因转录水平 66h 处最高。 2. 拟穴青蟹一氧化氮合成酶 NOS 克隆及鉴定。 利用 RACE 获得 NOS cDNA 序列，其全长 4426bp，5’端和 3’端非编码序列分别 为 239bp 和 538bp，开放阅读框 3645bp，编码 1214 个氨基酸。该酶等电点为 6.56，没有 信号肽，没有跨膜结构，含有 10 个糖基化及 68 个磷酸化修饰位点，说明拟穴青蟹 NOS 酶活性及功能可能受磷酸化和糖基化修饰及调节，并且该酶不属于膜蛋白，其存在于细胞 质及细胞间质内。青蟹 NOS 与哺乳动物和昆虫纲 NOS 亲缘关系较远，跟软甲纲动物亲缘 关系较近，且广泛表达于青蟹不同组织中。拟穴青蟹副溶血弧菌、脂多糖胁迫、polyI：C 等刺激条件下，其中肠、肝胰腺、血细胞中 NOS 基因的表达及 NOS 酶活力均有不同程度 的上调，这说明 NOS 基因参与拟穴青蟹免疫应激反应，具有免疫相关功能。 3.青蟹 NOS 启动子序列的克隆及初步分析 利用染色体步移技术，得到了拟穴青蟹一氧化氮合成酶 NOS 基因 5’端上游侧翼序列 II II 1722bp；结果显示，该段上游侧翼序列包括一个基础启动子区域，具有 TATA 框和 CAAT 框等一般启动子特征，另外该段测序序列还存在很多潜在顺式作用元件。Neural Network Promoter Prediction 启动子预测软件，结果表明正链在-277~ -228 处存在可能的基础启动 子区域，其 cutoff 值为 0.98。另外启动子的启动活性正在进一步研究之中。 本研究的主要创新之处：①.本研究结合生化检测及基因表达角度，研究拟穴青蟹在 副溶血弧菌注射后，其免疫相关因子应答特性。②.克隆了拟穴青蟹 NOS 基因 cDNA 全长， 初步预测了 NOS 理化性质和蛋白结构功能，并分析了该基因的组织特异性及应激表达特 性。③.克隆了 NOS 基因 5’端上游侧翼序列，初步预测分析了其基本启动子区域、转录起 始位点和潜在顺式作用元件。 关键词：拟穴青蟹; 免疫应答; 一氧化氮合成酶；表达谱；启动子 PAGE PAGE IV Abstract Mud crab is one of the economically important aquacultural crabs in t