低氧微环境下内皮细胞自噬与凋亡之间作用的研究-肿瘤学专业论文.docx

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 低氧微环境下内皮细胞自噬与凋亡之间关系的研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心 武汉 430022 博士研究生：张瑞光 导 师：伍 钢 教授 摘 要 第一部分:低氧微环境对内皮细胞自噬的诱导 目的：低氧微环境在肿瘤组织的生长、代谢以及耐药过程中发挥着重要的作用。 然而，肿瘤细胞以及肿瘤组织中的内皮细胞逃避低氧微环境对其损害的机理尚未 完全明了。本研究拟初步探讨低氧微环境下内皮细胞自噬的发生及其机制。 方法：通过三气培养箱建立低氧微环境；通过透射电镜检测低氧微环境下培养的 内皮细胞内是否出现自噬小体；RT-PCR 法检测低氧条件下自噬相关基因的表达； 激光共聚焦显微镜检测自噬小体表面微管相关蛋白 1 的轻链 3（LC3）的表达、 单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法以及吖啶橙染色法定量检测不同长度的低氧时间 下自噬小体数目，统计学分析低氧微环境与内皮细胞自噬之间的关系。 结果：透射电镜检测显示，低氧微环境培养下的内皮细胞内能够观察到自噬小体 的存在，表现为空泡样双层膜结构，电子密度高，提示低氧微环境能够诱导内皮 细胞自噬的产生。RT-PCR 结果显示，低氧条件下，内皮细胞自噬相关基因的表 达上调；激光共聚焦显微镜检测显示，低氧条件下培养的内皮细胞内，含 LC3-GFP 颗粒的自噬小体明显增多，与低氧微环境具有相关性。MDC 以及吖啶橙染色法 显示，随着低氧时间的延长，细胞内自噬小体的出现明显增加，自噬与低氧时间 之间存在有相关性，且低氧诱导的自噬具有可逆性。 结论：低氧微环境能够诱导内皮细胞发生自噬，且这一现象与低氧时间之间存在 有相关性。 关键词：低氧；自噬；自噬小体 第二部分 低氧微环境诱导内皮细胞自噬的调控通路 目的：调控自噬的分子机制分为依赖mTOR以及非依赖mTOR的分子通路。本研 究拟通过应用 class III PI3K 的抑制剂 3-MA 、 mTOR 的抑制剂雷帕霉素以及 MPKAp38抑制剂SB202190，探讨调控低氧微环境下内皮细胞自噬的分子机制。 方法：通过三气培养箱建立低氧微环境；体外通过 PI3K 的特异性抑制剂 3-MA、 mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素以及 MPKAp38 的特异性抑制剂 SB202190 干预 内皮细胞，激光共聚焦显微镜检测自噬小体表面微管相关蛋白 1 的轻链 3（LC3） 的表达、单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法以及吖啶橙染色法定量各处理组自噬小 体的数量，统计学分析三种不同类型抑制剂与内皮细胞自噬之间的关系。 结果：免疫印迹法检测显示，雷帕霉素能够降低 mTOR 的磷酸化水平，SB202190 能够抑制 MAPKp38 的磷酸化。在应用三种不同类型的抑制剂后，激光共聚焦显 微镜检测显示,3-MA 处理组内皮细胞内含 LC3 的自噬小体数量明显减少，而雷 帕霉素处理组内皮细胞内的自噬小体数量明显增加，SB202190 处理组内皮细胞 内自噬小体的数量没有明显变化。MDC 染色以及吖啶橙染色法同样提示 3-MA 能够抑制内皮细胞内自噬小体的产生，而雷帕霉素则会增强自噬活性，SB202190 则没有这样的作用。 结论：class III PI3K 参与调解低氧微环境下内皮细胞自噬的正性，而 mTOR/class I PI3K/Akt 通路则对低氧条件下的内皮细胞的 自噬具有负性调节作用，而 MAPKp38 通路则对这一过程没有影响。 关键词：自噬；PI3K；mTOR; MAPKp38 第三部分 低氧诱导自噬对内皮细胞凋亡的影响 目的：低氧微环境下，内皮细胞同时存在凋亡与自噬两种程序性细胞死亡方式。 本研究拟通过采用自噬特异性抑制剂3-MA，探讨自噬对内皮细胞凋亡的影响。 方法：通过三气培养箱建立低氧微环境；体外采用自噬特异性抑制剂作用内皮细 胞后，流式细胞仪检测内皮细胞的凋亡水平，caspase-8、caspase-9活性试剂盒检 测细胞凋亡的调控通路；采用caspase活性抑制剂Z-DEVD-FMK作用内皮细胞后， MDC染色法检测细胞自噬水平的变化；Transwell小室迁移法以及鬼笔环肽染色 法检测抑制内皮细胞自噬后，细胞的功能改变。 结果：流式细胞仪检测显示，采用3-MA抑制内皮细胞的自噬发生后，细胞的凋 亡水平明显上升；caspase-8、caspase-9活性检测提示，采用3-MA抑制以后， caspase-8的活性未见明显变化，而caspase-9的活性则明显升高，提示自噬抑制内 皮细胞凋亡主要通过线粒体调控通路进行；采用transwell小室迁移法以及鬼笔环 肽检测内皮细胞的功能，结果显示，采用3-MA抑制细胞自噬以后，内皮细胞的 迁移能力